SPIO對兩種干細胞生物學特性影響及利用磁靶向技術進行細胞遷移的初探.pdf

1、背景和目的：齲病和牙周病是臨床常見疾病、多發(fā)病，往往造成牙髓壞死和牙槽骨吸收以致牙齒缺失?，F(xiàn)有的診療技術往往無法真正意義上實現(xiàn)牙髓、牙周組織的生理性和功能性再生。因此，在當代口腔醫(yī)學領域，牙髓和牙周組織再生治療仍然是學者們研究的熱點。隨著組織工程技術的不斷發(fā)展，外源性干細胞植入和自體干細胞歸巢療法在許多組織器官再生的實驗研究中已經(jīng)被廣泛開展。然而，由于牙齒解剖結構的特殊性，學者們往往難以將干細胞有效的遷移并富集在牙髓或者牙周組織，同時在

2、進行干細胞治療過程中也無法對植入的干細胞進行示蹤觀察，這些都對牙髓和牙周組織原位再生帶來了極大的挑戰(zhàn)。
　　近年來出現(xiàn)的磁靶向技術可以極大的促進植入的干細胞在靶器官的遷移和定植，同時與之相輔相成的臨床MRI檢測手段還可以對植入細胞進行無創(chuàng)的示蹤觀察，這些都為學者進行牙髓和牙周組織再生指明了新的研究方向。在本試驗中，我們首先選擇了一種新的自帶熒光且無需轉染劑的 SPIO（MIRB）對人牙髓干細胞進行了標記，探討了對其活力、增殖、分化

3、等一系列生物學影響，進一步通過MRI技術對裸鼠皮下植入的細胞進行無創(chuàng)示蹤觀察。接下來我們用SPIO標記了大鼠骨髓間充質干細胞，在體外磁場環(huán)境下誘導細胞遷移，同時構建大鼠牙槽骨缺損模型，從靜脈注射以及局部注射兩種細胞輸入途徑進行研究，觀察體內環(huán)境下磁靶向技術在促進干細胞在牙槽骨缺損處的遷移和定植。本實驗實現(xiàn)了MRI活體示蹤觀察植入的干細胞，還豐富了磁靶向技術在牙周組織再生中的運用，為未來牙周再生干細胞療法提供了新思路。結果如下：
　

4、　第一部分 MIRB標記對hDPSCs的生物學影響以及體內體外MRI成像
　　1.人牙髓干細胞（hDPSCs）培養(yǎng)和鑒定。本研究采用酶消化法/組織塊法從成人第三磨牙牙髓組織中分離培養(yǎng)人DPSCs，利用單細胞克隆法純化細胞，通過體外成骨、成脂誘導分化以及流式細胞儀鑒定確定了其干細胞屬性。
　　2. MIRB標記hDPSCs。分別用終濃度為12.5，25，50，100μg Fe/mL的SPIO（MIRB?）標記hDPSCs，利用

5、激光共聚焦、普魯士藍染色光鏡觀察以及透射電鏡等手段觀察了SPIO納米顆粒在 hDPSCs細胞內的分布情況，分光光度計測量了各組細胞內鐵含量。結果發(fā)現(xiàn)， MIRB可以不需要轉染劑即可高效的標記hDPSCs，各種濃度標記后對細胞的形態(tài)沒有影響，且隨著標記濃度的升高細胞內鐵含量也逐漸上升。
　　3. MIRB對hDPSCs體外生物學特性的影響。采用臺盼藍排斥實驗、CCK8實驗、流式細胞儀、體內外成骨誘導等手段分別檢測了 MIRB標記對

6、hDPSCs的活力、增殖、干細胞表型、細胞周期、凋亡以及成骨分化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，12.5-50μg/mL的MIRB標記不影響hDPSCs的活力且可以促進細胞增殖，而100μg/mL則對細胞有毒性，最佳標記濃度為12.5μg/mL；12.5μg/mL的MIRB標記不影響hDPSCs的干細胞表型；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB標記可以加快細胞周期而對細胞凋亡無影響；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB對hDPSCs成

7、骨分化無影響。
　　4. MIRB標記牙髓干細胞的體外、體內MRI成像觀察。通過MRI檢測手段，體外觀察了MIRB標記的hDPSCs細胞團塊，體內觀察了MIRB標記的細胞膜片在裸鼠皮下的生長情況。體外結果發(fā)現(xiàn)，12.5μg/mL的MIRB標記1×105個細胞無法在MRI清晰顯影，而用12.5μg/mL-100μg/mL的MIRB標記1×106個細胞均可清晰顯影。體內結果發(fā)現(xiàn)，MIRB標記的hDPSCs細胞膜片在MRI下可以清晰呈負

8、性對比影像，且隨著植入時間延長，無信號影像所占比率也逐漸下降。組織學檢查發(fā)現(xiàn)，膜片內普魯士藍陽性染色細胞數(shù)量也隨著時間的延長而逐漸下降。
　　第二部分SPIO對大鼠骨髓間充質干細胞的生物學影響
　　1.大鼠骨髓間充質干細胞（rBMMSCs）培養(yǎng)和鑒定。成功采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質干細胞（rBMMSCs）。通過克隆形成實驗、干細胞表型測定以及多向分化能力檢測確定其干細胞屬性。
　　2. Resovist標記r

9、BMMSCs。分別用終濃度為25、50、100μg/mL的SPIO（Resovist）標記rBMMSCs，利用普魯士藍染色光鏡觀察以及透射電鏡等手段觀察了 Resovist納米顆粒在 rBMMSCs細胞內的分布情況。結果發(fā)現(xiàn)， Resovist同樣可以不需要轉染劑即可高效的標記rBMMSCs。
　　3. Resovist對rBMMSCs生物學特性的影響。采用臺盼藍排斥實驗、CCK8實驗、流式細胞儀、體外成骨誘導等手段分別檢測了Re

10、sovist標記對rBMMSCs的活力、增殖、細胞周期、凋亡以及成骨分化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，25-50μg/mL的Resovist對rBMMSCs活力沒有影響，而100μg/mL對細胞有毒性；25μg/mL不影響細胞增殖、細胞周期以及凋亡，而50-100μg/mL則抑制細胞增殖、減緩細胞周期并促進細胞凋亡，說明25μg/mL的Resovist是標記rBMMSCs的合適濃度；25μg/mL的Resovist對rBMMSCs的成骨分化有促進作

11、用。
　　第三部分 SPIO標記的大鼠骨髓間充質干細胞在體外體內磁場環(huán)境下遷移和定植的實驗研究
　　1.體外磁場環(huán)境下SPIO標記的rBMMSCs遷移實驗。利用Transwell小室，在體外磁場環(huán)境下觀察SPIO標記的rBMMSCs的穿膜能力。結果發(fā)現(xiàn)，磁場可以明顯促進SPIO標記的細胞穿膜。另外，我們在培養(yǎng)皿底部正中心粘貼磁鐵，將SPIO標記的rBMMSCs接種后觀察細胞在培養(yǎng)皿內的分布情況，發(fā)現(xiàn)細胞圍繞磁鐵周圍呈圓環(huán)狀分

12、布。
　　2.體內磁場環(huán)境下SPIO標記的rBMMSCs向牙槽骨缺損處的磁靶向遷移或定植。構建大鼠牙槽骨缺損模型，分別從靜脈途徑和局部注射途徑輸入SPIO標記的干細胞。結果發(fā)現(xiàn)，從靜脈輸入的干細胞大部分被脾臟內巨噬細胞所吞噬，在牙槽骨缺損處未見到遠距離遷移的干細胞，而局部注射標記后的干細胞由于有磁場作用可以大量聚集在牙槽骨缺損處。
　　結論：
　　1．第一部分研究結果表明，目前市售的最新的納米鐵顆粒MIRB可以無需添加

13、額外的轉染劑即可高效標記人牙髓干細胞；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB標記人牙髓干細胞是安全可靠的；MRI可以對植入體內的hDPSCs細胞膜片進行無創(chuàng)實時觀察，是干細胞移植治療中進行細胞示蹤安全有效的手段，為未來利用牙髓干細胞移植進行牙髓原位再生提供了實驗依據(jù)。
　　2．第二部分研究結果發(fā)現(xiàn)，德國Schering的納米鐵顆粒Resovist同樣可以無需轉染劑即可高效標記大鼠骨髓間充質干細胞；25μg/mL的Resovi

14、st不影響大鼠骨髓間充質干細胞的增殖和活力，50-100μg/mL的Resovist則抑制rBMMSCs增殖、減緩細胞周期并促進細胞凋亡，說明25μg/mL的Resovist是標記rBMMSCs的合適濃度；25μg/mL的Resovist對rBMMSCs的成骨分化有促進作用，其具體機制還需進一步深入探究。
　　3．第三部分研究結果表明，體外磁場環(huán)境下可以完美模擬出標記了SPIO的干細胞在磁場作用下發(fā)生靶向遷移；體內環(huán)境下，構建了牙