中國林蛙真?zhèn)纹返姆肿予b別及其性別的分子鑒定.pdf

1、中國林蛙在分類學(xué)上屬于脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、兩棲綱、無尾目、蛙科、林蛙屬，俗稱哈士蟆、黃蛤蟆等，醫(yī)學(xué)上稱之為田雞。 中國林蛙具有重要經(jīng)濟(jì)意義和醫(yī)療保健價(jià)值。其干制全體入藥，歷代本草均有記載。雌蛙輸卵管干制品入藥，稱哈士蟆油或哈蟆油，也稱“田雞油”，為名貴的動(dòng)物藥材?，F(xiàn)在市場上作為哈蟆油商品的，從商品形式上分，有干燥原只和已剝好的油(雌蛙輸卵管)兩種。現(xiàn)在市場上有類似品黑龍江林蛙，偽品黑斑蛙和蟾蜍。該藥材鑒定目前仍主要依據(jù)性狀

2、特點(diǎn)、顯微特征、理化性質(zhì)等，但由于該藥材缺乏明顯的形態(tài)鑒別特征和特殊的化學(xué)成分，實(shí)踐中哈蟆油的鑒定仍感到十分困難。為了使不法商販無利可徒，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，本研究設(shè)計(jì)了五對(duì)引物對(duì)四個(gè)物種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看四個(gè)物種擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)別，從而對(duì)其進(jìn)行分子鑒別。 如何有效地控制性比是林蛙養(yǎng)殖業(yè)中一個(gè)有待解決的問題。為了從根本上解決這個(gè)問題，首先必須知道雌雄個(gè)體間的差異及遺傳背景。此外，兩棲類動(dòng)物處于進(jìn)化的中間過渡位置，在高等動(dòng)物中能看到異型性

3、染色體，而在低等動(dòng)物中不能，因此，就有可能從兩棲類中找到過渡類型，為研究染色體的演化提供一些理論幫助。所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了七對(duì)引物和一個(gè)引物組合對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)雌雄擴(kuò)增結(jié)果的差別，從而達(dá)到性別鑒定的目的，為中國林蛙的性別研究提供遺傳依據(jù)。 兩棲類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究，主要依據(jù)宏觀形態(tài)學(xué)和染色體學(xué)來分析物種的親源關(guān)系是不夠的。由于分子系統(tǒng)學(xué)及DNA分子技術(shù)的快速發(fā)展，使從DNA水平研究兩棲類物種的親源關(guān)系成為可能。隨著mtDN

4、A序列的大量積累，人們越來越迫切的想得到核DNA的信息，來對(duì)mtDNA的資料進(jìn)行補(bǔ)充。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)四個(gè)物種用第四對(duì)引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，以期為探討兩棲類性別決定基因和系統(tǒng)發(fā)育提供分子依據(jù)。 本研究結(jié)論如下： 1.用第四對(duì)引物(根據(jù)WZ染色體上的EcoRI家族設(shè)計(jì))進(jìn)行中國林蛙偽品鑒別，中國林蛙擴(kuò)增843bp的特征帶。黑龍江林蛙有223bp的特征帶，黑斑蛙有434bp的特征帶，蟾蜍有70

5、4bp的特征帶。第五對(duì)引物(根據(jù)牛SRY基因設(shè)計(jì))可以對(duì)藥源林蛙種間進(jìn)行分子鑒別。中國林蛙有250bp的特征帶；黑龍江林蛙有550bp、750bp、1400bp的特征帶。 2.CHD1+2引物組合可以對(duì)中國林蛙進(jìn)行性別鑒定，雌性有600bp的雌性特異帶。 3.根據(jù)雞WZ染色體上的EcoRI家族重復(fù)序列設(shè)計(jì)的第四對(duì)引物，對(duì)四個(gè)物種擴(kuò)增序列克隆測序，將所獲得結(jié)果進(jìn)行BLAST比較分析發(fā)現(xiàn)：黑斑蛙的這段序列與雞的同源性達(dá)到98