棉花秸稈木質(zhì)纖維素降解及其青貯復(fù)合菌系的篩選和協(xié)同機(jī)理研究.pdf

1、為推進(jìn)我國新疆棉稈作為粗飼料利用的進(jìn)程，緩解新疆飼草資源短缺，針對棉花秸稈降解方面的研究，首先對棉花秸稈的預(yù)處理進(jìn)行優(yōu)化，確定其最適預(yù)處理方法;其次篩選適宜棉花秸稈青貯的乳酸菌復(fù)合菌系和木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系。從青貯樣品中、禾本科牧草中分離乳酸菌，利用16SrDNA和生理生化指標(biāo)測定對乳酸菌株進(jìn)行鑒定。采用PCR-DGGE技術(shù)對青貯復(fù)合系的穩(wěn)定性和多樣性進(jìn)行分析;篩選降解棉花秸稈纖維素復(fù)合系，利用微生物分泌的纖維素復(fù)合酶加快木質(zhì)纖維素分

2、解，測定纖維素復(fù)合系的降解能力和酶活性，采用PCR-DGGE技術(shù)對木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的穩(wěn)定性和多樣性進(jìn)行分析。
　　棉稈預(yù)處理和酶解，在堿與微波同時處理基礎(chǔ)上添加綠色木霉處理失重率最高(18.90％)，堿與微波同時處理后添加綠色木霉處理酶解率最好(31.84％);硫酸處理糖化率最高(18.30％);堿與微波同時處理后的棉桿經(jīng)綠色木霉處理后葡萄糖得率最高(1.01％)，預(yù)處理和酶解都能提高纖維素的降解率。
　　青貯乳酸菌的

3、鑒定結(jié)果，鑒定出了8種分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenniformis）、面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、腸球菌屬（Enterococcus）、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和芽孢桿菌屬(Bacil

4、lus)。篩選出了適合棉花青貯的青貯復(fù)合菌系，青貯復(fù)合菌系連續(xù)培養(yǎng)到第20代后趨于穩(wěn)定，通過PCR-DGGE分析和測序結(jié)果，青貯復(fù)合菌系主要由B.lichenniformis，L.crustorum，L.rhamnosus和L.casei組成。
　　分離出了降解木質(zhì)纖維素的菌株5株，在連續(xù)培養(yǎng)20d，對纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為XT4:20.91％、13.71％; XT3:21.43％、9.46％; XT2:22.19％、11.

5、76％; XM4:16.74％、11.45％; XM3:19.74％、11.16％。把5株纖維素降解菌與木質(zhì)素降解菌黃孢原毛平革菌進(jìn)行混合發(fā)酵，通過固體發(fā)酵20d，混合發(fā)酵能夠提高棉花秸稈中木質(zhì)纖維素降解率，結(jié)果分別為XT2+PC:34.26％、25.44％; XT3+PC:29.29％、28.69％、XT4+PC:35.09％、27.61％、XM4+PC:27.67％、32.4％; XM3+PC:44.11％、19.5％。棉稈木質(zhì)纖維

6、素降解菌株初步鑒定結(jié)果T2、M3和T4為Claodosporium、Aspergillus、Penicillium; T3為Bacillus subtilis，M4為Bacillus megaterium。
　　采用PCS培養(yǎng)基對牛糞、土壤、瘤胃和發(fā)酵糞中篩選纖維素分解復(fù)合菌系，進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的復(fù)合菌系，在連續(xù)繼代20代后，仍保持穩(wěn)定的降解效果。對棉稈木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化;對木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系進(jìn)行了

7、優(yōu)化，氮源種類、發(fā)酵起始pH和接種量對CMC、FPA、β-G酶活和糖化率和失重率的影響達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)，溫度對FPA酶和失重率的影響達(dá)到顯著水平(p＜0.05)，對糖化率的影響達(dá)到顯著水平(p＜0.05)，對CMC、β-G酶的影響未達(dá)到顯著水平。得出最優(yōu)的發(fā)酵工藝為:溫度42℃，氮源(NH4)2SO4，接種量1.0％，發(fā)酵起始pH值7.0。
　　添加PEG6000的內(nèi)切酶、β-G和FPA酶活性增加幅度最高，分別達(dá)到9

8、3.33％，136.93％和73.15％，PEG4000對外切酶活性增幅最大;PEG6000能提高M(jìn)nP和LiP酶的活性，分別為110.89％和62.29％。PEG2000、4000、6000和8000，纖維素降解率由沒有添加表面活性劑的19.48％分別提高到24.5％，26.71％，33.1％和30.01％;木質(zhì)素纖維素降解率對照的9.91％分別提高到19.21％，22.51％，30.45％和27.76％，其中PEG6000效果最好。

9、添加3.0g/L PEG6000纖維素的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到58.12％(p＜0.05);添加3.0g/L PEG6000能保持上清液中較高的蛋白濃度，水解3h后，沒有PEG6000,FPA從0.1245 FPU/mL下降到0.012FPU/mL，下降了90.37％，添加PEG6000，F(xiàn)PA酶的活性恢復(fù)到0.041FPU/mL;水解48h，添加PEG6000和不添加PEG6000纖維素的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到65.71％和54.68％，添加PEG

10、6000提高纖維素轉(zhuǎn)化率20.18％。PEG6000可以提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化率。
　　青貯復(fù)合菌系、木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系與白腐菌協(xié)同作用測定結(jié)果，白腐菌與木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系發(fā)酵，β-G葡萄糖苷酶(β-G)、錳酶(MnP)和漆酶(Lac)分別提高了23.34％、85.85％和150.00％;青貯復(fù)合菌系與木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系發(fā)酵， CMC和β-G酶分別被提高了41.98％和48.22％。青貯復(fù)合菌系、木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系與

11、白腐菌協(xié)同發(fā)酵，Lac、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、CMC和β-G分別被提高了50.00％、41.18％、29.75％和84.85％。木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系發(fā)酵，葡萄糖轉(zhuǎn)化系數(shù)最高達(dá)26.86％。棉稈失重率為24.27％～52.87％。青貯復(fù)合菌系、木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系與白腐菌協(xié)同發(fā)酵，半纖維素被降解42.69％，纖維素被降解44.30％，木質(zhì)素被降解30.45％。CP含量被提高5.06％～9.37％。白腐菌與木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系發(fā)