染色質(zhì)重塑酶SRCAP促進(jìn)同源重組修復(fù)的分子機(jī)制.pdf

1、我們每個(gè)細(xì)胞的基因組DNA每天要遭受來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外大約十萬(wàn)次的各種損傷，其中DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks，DSBs)是最具威脅的DNA損傷類型，如果不修復(fù)或不準(zhǔn)確修復(fù)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、突變累積、基因組不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生。因此細(xì)胞衍生了同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)來(lái)應(yīng)對(duì)DSB損傷的威脅，其中HR修復(fù)依賴于同源DNA模板是一種高保真的修復(fù)方式，而NHEJ可在沒(méi)有同源模板的情況下直接將斷裂的兩個(gè)DNA

2、末端連接起來(lái)，是一種錯(cuò)誤傾向的修復(fù)機(jī)制，因此HR在維持基因組穩(wěn)定過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。HR修復(fù)途徑的起始取決于DSB末端是否切割產(chǎn)生3'ssDNA。在脊椎動(dòng)物中，MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復(fù)合物和CtIP共同協(xié)作發(fā)起DSB末端5'→3'ssDNA的切割，然而基因組DNA都處于以核小體為基本單位的染色質(zhì)緊密折疊結(jié)構(gòu)中，DNA的這種組織結(jié)構(gòu)是DSB末端切割的天然屏障，這也就使得染色質(zhì)重塑因子介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改造成為有效發(fā)起DS

3、B末端切割的重要步驟，但目前對(duì)于DSB末端切割發(fā)起過(guò)程起作用的染色質(zhì)重塑因子還知之甚少。SRCAP是屬于INO80家族的ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶，SRCAP突變是導(dǎo)致Floating-Harbor syndrome的主要原因，但SRCAP在DNA損傷修復(fù)中的功能至今不清楚，因此我們猜想SRCAP是否可能通過(guò)染色質(zhì)重塑參與DSB修復(fù)過(guò)程。
　　首先我們驗(yàn)證了SRCAP是否直接參與DSB修復(fù)過(guò)程，結(jié)果顯示SRCAP敲減顯著降低DSB損

4、傷細(xì)胞的存活率和修復(fù)效率，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明SRCAP能迅速被招募至DSB損傷位點(diǎn)直接參與修復(fù)過(guò)程。DSB損傷主要通過(guò)HR和NHEJ修復(fù)完成，利用HR報(bào)告分析系統(tǒng)和HR修復(fù)核心重組酶RAD51在DSB位點(diǎn)的招募實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)SRCAP敲減顯著抑制HR修復(fù)和RAD51的招募，因此SRCAP促進(jìn)DSB修復(fù)通過(guò)HR。 DSB末端切割決定了HR修復(fù)過(guò)程的發(fā)起，因此我們首先驗(yàn)證SRCAP缺失是否影響DSB末端切割，結(jié)果顯示SRCAP敲減顯著抑制DSB

5、末端切割產(chǎn)生3'ssDNA，而切割產(chǎn)生的3'ssDNA也是ATR/CHK1介導(dǎo)的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活的重要信號(hào)，所以我們發(fā)現(xiàn)SRCAP敲減后CPT和IR誘導(dǎo)的CHK1和RPA2磷酸化激活受阻。因此SRCAP通過(guò)促進(jìn)DSB末端切割起始HR修復(fù)，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)ATR依賴的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活引起細(xì)胞周期阻滯給HR修復(fù)贏得了時(shí)間。
　　DSB末端切割由MRN復(fù)合物和CtIP共同協(xié)作發(fā)起，為了解析SRCAP促進(jìn)DSB的末端切割的具體機(jī)制，我們首

6、先檢查SRCAP敲減對(duì)MRN復(fù)合物和CtIP在損傷位點(diǎn)招募的影響，多方面的結(jié)果表明SRCAP敲減顯著抑制CtIP在DSB位點(diǎn)的招募，但對(duì)NBS1的招募沒(méi)有影響，因此SRCAP通過(guò)促進(jìn)CtIP招募發(fā)起DSB末端切割。接下來(lái)我們進(jìn)一步探討SRCAP促進(jìn)CtIP招募的可能機(jī)制，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SRCAP和CtIP存在較好的相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明CtIP蛋白上(36-50aa)的SRCAP結(jié)合序列缺失導(dǎo)致CtIP在DSB位點(diǎn)招募和切割的

7、缺陷，因此SRCAP通過(guò)直接結(jié)合招募CtIP行使DSB末端切割功能。
　　另外SRCAP是一個(gè)ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶，因此我們猜想SRCAP介導(dǎo)的ATP依賴的染色質(zhì)重塑可能是它促進(jìn)CtIP招募的另一分子機(jī)制，結(jié)果顯示SRCAP敲減使細(xì)胞染色質(zhì)處于更緊密的折疊狀態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)用染色質(zhì)松弛藥物處理SRCAP敲減細(xì)胞能使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常折疊狀態(tài)，有意思的是染色質(zhì)松弛藥物也使CtIP招募的缺陷得到部分回復(fù)。進(jìn)一步基因回補(bǔ)拯救實(shí)驗(yàn)表明SR

8、CAP的ATP酶活性對(duì)染色質(zhì)緊密折疊結(jié)構(gòu)的松弛和CtIP的招募都是必需的，因此SRCAP介導(dǎo)ATP依賴的染色質(zhì)重塑是其促進(jìn)CtIP招募的另一分子機(jī)制。
　　綜上所述，當(dāng)DSB發(fā)生時(shí)，SRCAP能快速招募至DNA斷裂位點(diǎn)，并以兩種機(jī)制促進(jìn)CtIP的招募發(fā)起DSB末端切割過(guò)程，一方面通過(guò)ATP依賴的染色質(zhì)重塑介導(dǎo)的染色質(zhì)松弛，另一方面通過(guò)與斷裂末端切割蛋白CtIP的直接結(jié)合，從而促進(jìn)ATR/CHK1細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的激活和同源重組修復(fù)的