藍(lán)細(xì)菌光敏色素及藻紅蛋白的生物合成研究.pdf

1、藍(lán)藻是地球上分布最廣泛、最原始的放氧光合作用原核生物,在適宜水體中會(huì)大量生長(zhǎng)繁殖,形成藍(lán)藻水華。藍(lán)藻的光合作用是從藻膽蛋白組成的藻膽體結(jié)構(gòu)吸收光能開(kāi)始的。藻膽蛋白是一個(gè)多亞基組成的蛋白復(fù)合物,每個(gè)亞基上結(jié)合不同的開(kāi)環(huán)四吡咯色素分子(色基),使得它們可以吸收不同波長(zhǎng)的光能。藍(lán)藻體內(nèi),藻膽色素與脫輔基藻膽蛋白的正確連接一般都需要特異的裂合酶來(lái)催化完成。目前已發(fā)現(xiàn)裂合酶CpcE/F催化脫輔基蛋白CpcA與藻藍(lán)色素PCB的連接,裂合酶PecE/

2、F催化PCB異構(gòu)為PVB并與脫輔基蛋白PecA連接,裂合酶CpeS1不僅催化PCB與CpcB和PecB的Cys-84位連接,同時(shí)也能催化PCB與脫輔基蛋白ApcA、ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF的連接。裂合酶CpeT1能催化CpcB和PecB的β亞基Cys-155位與藻藍(lán)色素PCB的偶聯(lián)。
　　本文以原核生物藍(lán)藻PCC7421藻紅蛋白(CPE)為研究對(duì)象,首先研究了CPE的生物合成。本文以已知的有活性的裂合酶進(jìn)行同源搜索

3、,找出了20個(gè)可能的裂合酶。利用共表達(dá)載體,將CPE脫輔基亞基CpeA或CpeB、合成色基的血紅素氧化酶HO1、氧化還原酶PebA、PebB及可能的裂合酶在大腸桿菌中共同表達(dá)。在裂合酶CpeY的催化作用下,大腸桿菌能夠利用自身的亞鐵血紅素合成具有與天然CPEα亞基一致的特征吸收和熒光光譜的重組色素蛋白holo-CpeA。裂合酶CpeS2對(duì)CpeB和PEB的共價(jià)結(jié)合有一定的催化活性。
　　Zhao等發(fā)現(xiàn)來(lái)自魚(yú)腥藻PCC7120的裂合

4、酶CpeS1能催化絲狀藍(lán)藻PCC7601中藻紅蛋白α亞基Cys-82位和β亞基Cys-80位與藻紅膽素PEB的偶聯(lián)。無(wú)類囊體藍(lán)藻PCC7421和絲狀藍(lán)藻PCC7601中的CPE有極高的同源性,我們將脫輔基蛋白替換為PCC7601中的CpeA(C82A)、CpeB(C80S/C165S)和CpeB(C48A/C59S/C80S)進(jìn)行體內(nèi)重組,但是未能找到有催化活性的酶或酶的組合。
　　植物光敏色素是一種重要的光受體,藍(lán)細(xì)菌光敏色素是

5、發(fā)現(xiàn)于藍(lán)藻內(nèi)的一種藻膽色素蛋白,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與植物光敏色素有較高的同源性,生理功能上與植物光敏色素也有很大的相似性,在藍(lán)藻內(nèi)起著光信號(hào)受體的作用。藍(lán)細(xì)菌光敏色素分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、易于進(jìn)行分子設(shè)計(jì),是研究光敏色素分子功能、生理機(jī)制的優(yōu)良模型。
　　本文以來(lái)自Anabaena sp.PCC7120的aphC基因及其編碼蛋白AphC為對(duì)象,對(duì)藍(lán)細(xì)菌光敏色素 AphC及其GAF結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)重組和體外重組及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　

6、首先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法從魚(yú)腥藻Anabaena sp.PCC7120總DNA中克隆出完整的aphC,同時(shí)通過(guò)同源性分析,構(gòu)建了以下aphC的4個(gè)定點(diǎn)突變體對(duì)其功能區(qū)域及功能氨基酸殘基進(jìn)行了分析,即:aphC(C138L),aphA(C478A),aphA(C554L)和aphA(C138L/C554L)。將這些基因片段構(gòu)建入表達(dá)載體 pET-30a(+)中,含目的基因的表達(dá)載體、血紅素氧化酶 HO1和膽綠素還原酶PcyA同時(shí)轉(zhuǎn)入大腸

7、桿菌體內(nèi)共表達(dá)。根據(jù)重組產(chǎn)物的光譜特征峰分析,發(fā)現(xiàn)色素蛋白PCB-AphC顯示出兩種獨(dú)立的可逆光致變色效應(yīng)。AphC中具有兩個(gè)獨(dú)立的可結(jié)合色素的GAF結(jié)構(gòu)域,分別是GAF1結(jié)構(gòu)域和GAF3結(jié)構(gòu)域。將單獨(dú)的GAF1和GAF3分別與PCB重組得到的產(chǎn)物也可以分別顯示出一種與 PCB-AphC一致的可逆光致變色效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明PCB-GAF1在700nm和570nm光照條件下分別表現(xiàn)為紅光吸收(λmax=636nm,Pr)和遠(yuǎn)紅外光吸收(λma

8、x=684nm,Pfr),PCB-GAF3在700nm和>610nm光照條件下分別表現(xiàn)為紅光吸收(λmax=644nm,Pr)和橙光吸收(λmax=584nm,Po)。色素蛋白經(jīng)酸性尿素變性后,紫外吸收峰值在662nm左右,表明所連接的色素為藻藍(lán)色素PCB。色素蛋白的蛋白質(zhì)電泳經(jīng)醋酸鋅染色后,在紫外光照射下發(fā)出鋅熒光,證明色素與蛋白的連接方式為共價(jià)偶聯(lián)。利用光譜數(shù)據(jù)可計(jì)算得到色素蛋白的熒光量子產(chǎn)率、摩爾消光系數(shù)等。
　　PCB-G

9、AF3的橙光吸收(Po)在黑暗條件下會(huì)快速的自發(fā)轉(zhuǎn)化為紅光吸收(Pr),PCB-GAF1的遠(yuǎn)紅外光吸收(Pfr)在黑暗條件下會(huì)緩慢的轉(zhuǎn)化為紅光吸收(Pr)。在-77K低溫狀態(tài)下,可以測(cè)得PCB-GAF3的橙光吸收型完整的熒光光譜。色素蛋白PCB-AphC、PCB-AphC(C138L)和PCB-AphC(C554L)經(jīng)純化后測(cè)圓二色譜,在紫外光區(qū)的圓二色譜顯示出α-螺旋結(jié)構(gòu)。AphC在C端有組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域,實(shí)驗(yàn)證明色素蛋白PCB-Ap