PCR增效劑對體外長基因片段合成效率影響的研究.pdf

1、后基因組時(shí)代,基于全基因組序列的研究越來越多,這就要求研究者們能夠在短時(shí)間內(nèi)以最高的效率獲得某一樣品的全基因組序列。就技術(shù)而言,目前全基因組序列的體外獲得主要是通過DNA體外拼接的方式完成,但大多數(shù)體外拼接方法都存在拼接長度有限、拼接效率低、步驟繁瑣和成本高等缺點(diǎn),本課題中采用的重疊延伸PCR和Gibson等溫一步拼接法就是兩種典型的DNA體外拼接技術(shù),然而重疊延伸PCR拼接技術(shù)的應(yīng)用受限于其拼接長度,而Gibson等溫一步拼接法拼接片

2、段長度雖然可以達(dá)到幾百kb,但是其成本卻很高,且拼接效率很低。近年來的一些研究成果表明納米材料和核內(nèi)小分子可以通過與DNA片段或DNA聚合酶相互作用,或者降低目的產(chǎn)物的Tm值等機(jī)制對DNA片段的PCR擴(kuò)增起到增效作用,受這些研究的啟發(fā),本課題將這些新型的PCR添加劑應(yīng)用于重疊延伸PCR拼接法和Gibson等溫一步拼接法中,從而對兩種拼接方法的拼接長度和拼接效率進(jìn)行了改善。
　　本課題主要進(jìn)行了四個(gè)方面的研究工作:含有重疊序列的短D

3、NA片段的獲得;小分子對重疊延伸PCR拼接效率影響效率的研究及增效小分子的篩選;小分子對Gibson Assembly拼接效率影響的研究及增效小分子的篩選;增效小分子增效機(jī)制的研究。
　　含有重疊序列的短DNA片段的獲得主要是通過設(shè)計(jì)接頭引物,并借助PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行。本課題共設(shè)計(jì)了15對接頭引物,利用這些接頭引物擴(kuò)增獲得的短DNA片段之間可人為添加上一段overlaps,overlaps有40bp、80bp和202bp三種長度

4、。這些短DNA片段進(jìn)行拼接可獲得長達(dá)6kb、10kb和27kb的長及超長DNA片段。
　　小分子對重疊延伸PCR和Gibson Assembly拼接效率影響的研究及增效小分子的篩選,則首先通過測試小分子的使用濃度、反應(yīng)條件、檢測方法等實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立了兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?然后將小分子添加在拼接體系中,通過觀察各組的拼接效率判斷各種小分子對兩種拼接方法拼接效率的影響,從而篩選出了具有增效作用的小分子。最終篩選出了一種對GibsonAssemb

5、ly具有增效作用的核內(nèi)小分子,是23號肌苷;三種對重疊延伸PCR具有增效作用的核內(nèi)小分子,分別為23號肌苷、29號異亮氨酸和32號纈氨酸;得到四種對重疊延伸PCR有增效作用的納米材料,分別為18號羧基化短雙壁碳納米管、39號短多壁納米碳管、48號羥基化的短多壁納米碳管和53號羧基化短多壁碳納米管。
　　對于小分子增效機(jī)制的研究主要通過Q-PCR的方法進(jìn)行測試。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)小分子可以顯著提高DNA擴(kuò)增的特異性,并將基因片段的Tm值