dSTORM超分辨成像技術(shù)的實(shí)現(xiàn)及其應(yīng)用.pdf

1、由于光的衍射作用，光學(xué)顯微成像技術(shù)一直受到瑞利判據(jù)的限制，其分辨率存在一定的極限:橫向分辨率約為200nm，軸向分辨率約為500nm。這種成像分辨率根本無(wú)法識(shí)別尺寸大多在幾納米到幾十納米之間的生物結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)等。目前已經(jīng)發(fā)展出多種能夠突破光學(xué)衍射極限的成像技術(shù)，稱為超分辨顯微成像技術(shù)(Super-Resolution ImagingMicroscopy)。常用的有受激發(fā)射光損耗成像技術(shù)、光激活定位顯微技術(shù)(Photoactivated

2、Localization Microscopy, PALM)、隨機(jī)光學(xué)重建技術(shù)(direct Stochastic OpticalReconstruction Microscopy, dSTORM)等。
　　本文首先在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)備上搭建了基于單分子定位的超分辨成像平臺(tái)并實(shí)現(xiàn)了超分辨成像技術(shù)dSTORM;接著利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(actin)和微管蛋白(tublin)的超分辨成像。隨后，本論文還對(duì)dSTORM技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件

3、及參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化以獲得最佳成像條件來(lái)提高成像分辨率，最終分辨率可達(dá)24nm;最后，將優(yōu)化后的dSTORM技術(shù)應(yīng)用于P小體(Processing Bodies)的超分辨成像。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:
　　(1)超分辨單分子檢測(cè)平臺(tái)的建立。硬件部分:通過(guò)在配有TIRF光路的尼康倒置顯微鏡上配備各種成像設(shè)備如聲光可調(diào)諧濾波器來(lái)實(shí)現(xiàn)激發(fā)光的開(kāi)關(guān)及光強(qiáng)控制、PFS系統(tǒng)米實(shí)現(xiàn)焦點(diǎn)漂移的校正、EMCCD實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的采集等實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)平臺(tái)的硬件平臺(tái)的搭

4、建;軟件部分:由于dSTORM是基于單分子定位檢測(cè)的成像技術(shù)，因此本文設(shè)計(jì)了基于單分子定位的成像算法，主要包括漂移校正、單分子的識(shí)別、超分辨圖像的重建算法等內(nèi)容。
　　(2) dSTORM成像技術(shù)的實(shí)現(xiàn)。采用光轉(zhuǎn)換有機(jī)合成染料Alexa Fluor647為探針來(lái)標(biāo)記細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白及微管蛋白在搭建好的超分辨成像平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了微絲及微管的dSTORM成像，獲得了常規(guī)顯微方式無(wú)法得到的精細(xì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　(3) dSTORM技術(shù)成

5、像條件及參數(shù)的優(yōu)化。通過(guò)分析dSTORM的原理及影響成像的各種因素，本論文實(shí)現(xiàn)了對(duì)其成像條件及參數(shù)的優(yōu)化，得到了最佳的實(shí)現(xiàn)條件。在該條件下，得到了更為清晰的細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，成像分辨率能達(dá)到24nm左右。
　　(4)利用優(yōu)化后的dSTORM實(shí)現(xiàn)P小體（Dcp1a蛋白）的超分辨成像。采用免疫染色的方法（Alexa Fluor647作為探針）標(biāo)記P小體的主要組成蛋白Dcp1a，利用優(yōu)化后的dSTORM技術(shù)得到了P小體在常規(guī)顯微方式下無(wú)法得