在聚丙烯酰胺凝膠上分別建立一種DNA、糖基化蛋白質(zhì)檢測方法的研究.pdf

1、目的:
　　 1.在聚丙烯酰胺凝膠上建立一種檢測DNA的方法;
　　 2.在聚丙烯酰胺凝膠上建立一種特異性檢測糖基化蛋白質(zhì)的方法。
　　 方法:
　　 1.DNA染料染色檢測法:選用堿性品紅作為染料，首先初步建立一種檢測方法，之后考察各個對染色結果產(chǎn)生影響的因素，如染色液組成、染色時間以及脫色時間等，確定各個條件，逐步完善初步建立的檢測方法，最終建立完整的DNA染料染色檢測方法。
　　 2.糖基化

2、蛋白質(zhì)熒光檢測法:選用丹酰肼作為染料，首先初步建立一種檢測方法，之后考察各個對染色結果產(chǎn)生影響的因素，如固定液組成、染色液組成、脫色液組成以及各個步驟的時間等，確定各個條件，逐步完善初步建立的檢測方法，最終建立完整的糖基化蛋白質(zhì)檢測方法。
　　 結果:
　　 1.建立了一種完整的DNA染料染色檢測方法，可在凝膠上檢測出10-20 pg/band的DNA，其靈敏度比商業(yè)化熒光染色試劑盒SYBR Gold高4倍，與GEHea

3、lthcare公司的DNA銀染試劑盒靈敏度相近，且機理實驗表明堿性品紅和DNA的結合方式為非嵌入式結合，與經(jīng)典EB熒光檢測法的嵌入式不同，無致畸毒性。本方法操縱步驟如下:
　　 (1)固定:將電泳后的凝膠置于50 ml固定液中固定30 min，固定液組成:40％乙醇/10％乙酸;
　　 (2)染色:將凝膠置于50 ml染色液中染色5 min，染色液的組成:0.04％堿性品紅水溶液;
　　 (3)水洗:將凝膠置于5

4、0 ml去離子水中洗滌2次，每次10s;
　　 (4)顯影:將凝膠置于50 ml0.1％鐵氰化鉀(35-50℃)顯影2min;
　　 (5)終止:將凝膠置于去離子水中(35-50℃)終止顯影。
　　 2.建立了一種完整的糖基化蛋白質(zhì)熒光染色檢測法，可在凝膠上檢測出2-8ng/band的糖基化蛋白質(zhì)，其靈敏度與商業(yè)化糖基化蛋白質(zhì)染色試劑盒Pro-Q Emerald相近。本方法操作步驟如下:
　　 (1)固定

5、氧化:將電泳后的凝膠放入固定氧化液固定氧化10m in，固定氧化液組成:40％乙醇/10％乙酸/0.5％高碘酸;
　　 (2)酸洗:將凝膠置于3％乙酸洗滌3次，每次5 min;
　　 (3)染色:將凝膠置于染色液中染色40 min，染色液組成:0.6％丹酰肼/0.5％氯化鎂/3％乙酸;
　　 (4)脫色:將凝膠置于脫色液一和二中各脫色10 min，脫色液一組成:0.1％乙酸鋅/3％乙酸，脫色液二組成:3％乙酸。<