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文檔簡介
1、惡性腫瘤一直尚未攻克,血液系統(tǒng)惡性疾病也是如此。但是現(xiàn)在造血干細胞移植(HSCT)為我們治療惡性血液病帶來了希望,經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展,HSCT在臨床的應用愈來愈廣泛,移植技術也日漸成熟,因為移植技術的進步,越來越多的患者能夠獲得生存的機會,但是HSCT后也具有不少的并發(fā)癥,而移植物抗宿主?。℅VHD)就是其中之一,在臨床上,移植術后的病人或多或少都會出現(xiàn)GVHD,輕者影響病人的生活質(zhì)量,重者引起移植失敗甚至死亡。所以很多研究致力于尋找更好的
2、解決這個問題的方法。
文獻中報道的急性 GVHD(acute-GVHD, aGVHD)和慢性 GVHD(chronic-GVHD,cGVHD)的發(fā)病機制都表明其是一個免疫相關的疾病。因此臨床上治療GVHD主要是激素及其他免疫抑制劑。但是,這些藥物對很多病人無效,而且有較多的副作用如感染等,MSCs治療 aGVHD是目前臨床中相對具有前景的一種細胞療法,并且其副作用很少,因此探究MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力具有較重要的臨床意義。
3、> 間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有多向分化能力,因此較多的應用于組織損傷的修復,但它具有的免疫抑制也一直受到廣大研究者的青睞,因此有些學者證明了其在臨床應用于免疫相關疾病的價值。但是目前對于MSCs具體的調(diào)節(jié)機制尚不清楚,其在臨床治療的不穩(wěn)定性也使得它的應用受到了限制。為了更好的探究其免疫調(diào)節(jié)的機制,為以后的臨床研究提供扎實的理論基礎,我們是否可以從表觀遺傳學去探討MSCs的調(diào)節(jié)機制呢?
基因表達的過程相當復雜,而且受多種因素
4、的調(diào)控,因此其調(diào)控的過程也相對復雜。核小體主要由兩部分組成,一個組蛋白八聚體,一段長約147bp的DNA,并且可發(fā)生如甲基化、去泛素化等多種修飾。
那么組蛋白修飾影響基因表達的方式是什么呢?首先,它能改變組蛋白與DNA結(jié)合,使染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)生改變,也可作用于啟動子,使其難以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而影響基因的表達。
組蛋白 H2A是一種重要的組蛋白,它的去泛素化能夠有效地調(diào)節(jié)基因的表達。因此本研究旨在在小鼠上探討組蛋白的一種
5、去泛素化酶MYSM1基因?qū)SCs的免疫學特性的影響,為了達到這個研究目的,通過采用基因編輯的技術將小鼠間充質(zhì)干細胞系中的MYSM1基因敲除,然后將培養(yǎng)基因修飾后MSCs的上清與小鼠脾臟淋巴細胞共培養(yǎng),觀察其對T淋巴細胞增殖的影響并檢測各種T淋巴細胞亞群所分泌因子的表達情況。
那么如何敲除小鼠間充質(zhì)干細胞系中的 MYSM1基因呢?擬采用CRISPR-Cas9技術將 MYSM1基因從小鼠 MSCs中敲除。我們首先利用CRISPR
6、/Cas9基因編輯技術將 MYSM1基因整合到 CRISPR中,然后用相應的CRISPR RNAs來指導MYSM1的降解,我們此技術借鑒于《Science》雜志中基于CRISPR-Cas9技術在細胞系中進行基因敲除的新方法,并交給公司Cas9慢病毒及帶有能夠特異剪切 MYSM1基因的 sgRNA序列的病毒,然后完成接下來的工作。該技術優(yōu)點在于其能夠在基因組的特異位點上進行敲除,而且敲除效率較高。同時為了篩選病毒轉(zhuǎn)染的細胞,我們在病毒中還
7、加入了嘌呤霉素抗性基因。在公司完成病毒的生產(chǎn)后開始接下來的工作。
研究主要分為2部分:
首先,利用帶有綠色熒光蛋白(GFP)標記的Cas9慢病毒感染小鼠間充質(zhì)干細胞系C3H10T1/2,用CRISPR-Cas9技術來達到剪切小鼠MYSM1基因的目的,并利用流式細胞術(FCM)觀察細胞表面的GFP表達情況來檢測其轉(zhuǎn)染效率。
其次,在成功轉(zhuǎn)染后,收集細胞內(nèi)的RNA及蛋白質(zhì),通過定量PCR(qPCR)及蛋白印記的
8、方法分別從MYSM1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面來檢測MYSM1基因是否被成功剪切。
鑒定證明成功敲除MYSM1基因后,先通過FCM驗證其對MSCs本身表面特異性標記表達的變化,然后通過與收取細胞上清與小鼠脾臟淋巴細胞共培養(yǎng)對其進行免疫調(diào)節(jié)功能的驗證。
通過實驗可以得出以下結(jié)果:
1.經(jīng)流式檢測細胞GFP的表達情況病毒轉(zhuǎn)染的效率高達99%;通過qPCR及蛋白印記法發(fā)現(xiàn)MYSM1基因已經(jīng)在小鼠MSCs中敲除,獲得
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