朊蛋白和去甲?；附Y(jié)構(gòu)與性質(zhì)的X射線譜學(xué)研究.pdf

1、金屬蛋白是一類以金屬離子為輔基的蛋白質(zhì)，在PDB數(shù)據(jù)庫中能找到的有結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中大約40％都屬于這個范疇。金屬蛋白廣泛的參與基礎(chǔ)生命活動，在新陳代謝的化學(xué)反應(yīng)中起到舉足輕重的作用。這些化學(xué)反應(yīng)往往伴隨著金屬離子結(jié)合位點(diǎn)周圍精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，因此精確測量這些結(jié)構(gòu)的變化對于闡述反應(yīng)機(jī)理是有重要意義的。X射線吸收譜是一種測量生物體系中金屬離子結(jié)合位點(diǎn)周圍精細(xì)結(jié)構(gòu)的有力工具，具有亞原子尺度的分辨率，同時不受樣品狀態(tài)的限制，無論是單晶、溶液還是鑲嵌

2、在膜上都可以測量，因此十分適合測量金屬蛋白中金屬結(jié)合位點(diǎn)局域結(jié)構(gòu)。
　　 朊蛋白(PrP)是一種錨定于細(xì)胞表面的銅結(jié)合蛋白，被認(rèn)為是傳染性海綿狀腦病(TSE)的致病因素。銅離子結(jié)合可以導(dǎo)致朊蛋白從正常構(gòu)象PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏?gòu)象PrPSc，而后者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中聚集沉淀會導(dǎo)致TSE。兔是為數(shù)不多的對TSE有抗性的哺乳動物之一，這種抗性被認(rèn)為是來自兔朊蛋白(RaPrPC)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。我們利用X射線近邊吸收譜結(jié)合基于多重散射理論的從頭

3、計算解析了兔朊蛋白C端銅結(jié)合位點(diǎn)局域三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，兩個組氨酸His95和His110，及其周圍的兩個氨基酸Gln97和Met108參與了銅離子的結(jié)合中。
　　 隨后我們純化了兔朊蛋白的四個突變體，H95A、H110A、H139A和H186A，以及人朊蛋白(hPrP)，并通過等溫滴定量熱法(ITC)計算了銅離子對兩種朊蛋白野生型和突變型的親和能力，利用動態(tài)光散射(DLS)測量了在加入銅離子以后人朊蛋白和兔朊蛋白聚集團(tuán)簇的半徑

4、。同時，我們利用與確定兔朊蛋白同樣的方法確定了重組人朊蛋白91-231 C端銅離子結(jié)合位點(diǎn)的精細(xì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示相比于兔朊蛋白的結(jié)構(gòu)，人朊蛋白結(jié)構(gòu)中配位基團(tuán)距離銅離子更近，與銅離子具有更強(qiáng)的相互作用，換句話說，銅離子與人朊蛋白的親和力更高，而且加入銅離子后對人朊蛋白結(jié)構(gòu)影響更大，更容易引起聚合，這與等溫滴定量熱法和動態(tài)光散射結(jié)果相吻合。這可能就是不同的種屬對TSE具有不同的抗性的原因。
　　 去甲?；?PDF)是一種廣泛存在于原

5、核生物中的酶，在蛋白質(zhì)合成的起始階段催化去甲基化反應(yīng)，其催化活性有強(qiáng)烈的pH和金屬離子依賴性。我們利用X射線吸收譜解析了鋅離子和鈷離子在結(jié)合到鉤端螺旋體PDF(LiPDF)和大腸桿菌PDF(EcPDF)活性位點(diǎn)的精細(xì)局域結(jié)構(gòu)。另外，我們比較了在不同的pH下和結(jié)合不同的離子時結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。結(jié)果顯示，去甲?；竝H和金屬離子依賴是由于在不同的pH或者結(jié)合不同金屬離子的時候，與金屬離子配位的最近鄰水分子的配位鍵長有差別。結(jié)合實驗數(shù)據(jù)和理論