電壓敏感鈉通道與捕鳥蛛毒素相互作用位點的研究.pdf

1、虎紋捕鳥蛛(Haplopelma schmidti)、敬釗纓毛蛛(Chilobrachysguangxiensis)、海南捕鳥蛛(Haplopelma hainanum)都分布于我國南方地區(qū)，屬于體型較大、毒性較強且稀有的捕鳥蛛。在本實驗室以前的工作中，分別從它們的粗毒中分離到了虎紋毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)、虎紋毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)、海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)、敬釗毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)，并通過電生理實驗了解這四種毒素對于電壓敏

2、感鈉通道(VGSCs)具有不同的選擇性及作用強度，但是具體相互作用機制仍然不清楚。本文試圖利用酵母雙雜交技術來部分解決這個問題。將編碼毒素成熟肽的基因序列連入pGBKT7(酵母雙雜交載體)，將編碼電壓敏感鈉通道膜外區(qū)的基因序列連入另一載體pGADT7。通過酵母雙雜交的手段，分別檢測到了以上四種毒素對hNav1.7、hNav1.5通道膜外區(qū)潛在的相互作用位點。HWTX-Ⅳ和hNav1.7的潛在的作用位點僅為通道結構域Ⅲ的S3-S4胞外連接

3、片段(DⅢ-S3-S4)。HWTX-Ⅰ與hNav1.7的潛在的作用位點為DⅠ-S3-S4、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S5-S6。HNTX-Ⅳ和hNav1.7的潛在的作用位點是DⅠ-S3-S4、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6。JZTX-Ⅲ和hNav1.7的潛在的作用位點是DⅠ-S3-S4、DⅠ-S5-S6、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S1-S2、DⅣ-S5-S6。進一步分析，發(fā)現(xiàn)JZTX

4、-Ⅲ與hNav1.5的潛在的作用位點是DⅠ-S1-S2、DⅡ-S3-S4，DⅢ-S3-S4。
　　 在本實驗室以前的工作中，已經(jīng)在膜片鉗上檢測了天然HWTX-Ⅳ對hNav1.7通道電流的抑制作用，其半數(shù)抑制量(IC50)為26 nM；JZTX-Ⅲ對bNav1.5有抑制作用，其IC50大約在300 nM附近(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本文中我們又在膜片鉗上檢測了天然的HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ，JZTX-Ⅲ對于hNav1.7通道電流的抑制能力

5、。其中毒素HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ對于hNav1.7通道電流的IC50分別為640 nM和22 nM。JZTX-Ⅲ在1μM濃度時，對hNav1.7通道電流沒有明顯抑制能力。這四個毒素對hNav1.7通道電流的抑制能力依次是：HNTX-Ⅳ≈HWTX-Ⅳ>HWTX-Ⅰ>>JZTX-Ⅲ。
　　 通過綜合分析酵母顯色和電生理的結果我們可以得出：1)HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ對hNav1.7通道的S5-S6這些膜外區(qū)中的大部分并沒有相互

6、作用；2)雖然電生理的結果，HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ對hNav1.7電流的抑制能力十分接近，但是通過分析酵母相互作用的結果，兩者的作用位點卻差異明顯。其中HWTX-Ⅳ能夠檢測到的作用位點僅有一個，而HNTX-Ⅳ有4處；3)通過分析酵母顯色結果，我們發(fā)現(xiàn)通道hNav1.5與hNav1.7之間，很可能是由于DⅡ-S3-S4和DⅢ-S3-S4這兩部分膜外區(qū)的差別，導致對JZTX-Ⅲ敏感性的不一樣。
　　 雖然VGSCs在S1-S2、

7、S3-S4膜外區(qū)的氨基酸在10個附近，但是在我們參看相關文獻后，預測其核心序列在6個氨基酸左右，我們直接在酵母雙雜交載體pGADT7的多克隆位點上插入編碼隨機的六個氨基酸的序列，從而組成一個隨機六肽文庫。我們通過2種方式構建了能夠用于酵母雙雜交的隨機六肽文庫。第一種方法是常規(guī)的，需要依賴酶切和連接的方式；而第二種方法是直接通過PCR來完成文庫質(zhì)粒構建的全新方法。兩種方法均能得到庫容量在10萬左右的高質(zhì)量隨機六肽文庫。隨后對兩種方法所得的

8、文庫，隨機挑選20個克隆進行測序。測序結果表明：兩個文庫都有70％的序列是符合設計初衷的編碼隨機六肽的序列，并且沒有一個重復序列，代表兩個文庫里面的復雜度良好。
　　 本文的另一個工作是建立了一種表達小分子生物活性多肽的方法。我們分別將編碼虎紋毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)，海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)，敬釗毒素-Ⅴ(JZTX-Ⅴ)的序列通過聚合酶鏈式反應(PCR)手段獲得，然后分別連接入表達載體pET-40b，接著轉(zhuǎn)入表達菌株BL2

9、1(DE3)，最后以乳糖為誘導物，來實現(xiàn)目的蛋白在大腸桿菌周質(zhì)空間的融合表達。經(jīng)過SDS-PAGE檢測，均能檢測到三種毒素以融合蛋白的形式表達。進一步將部分可溶的虎紋毒素-Ⅰ融合蛋白(帶組氨酸標簽)用鎳柱純化。純化后的產(chǎn)物通過透析、除鹽后，再加入腸激酶消化來釋放重組的虎紋毒素-Ⅰ(rHWTX-Ⅰ)，接著通過反相高效液相色譜法(RP-HPLC)來純化rHWTX-Ⅰ。經(jīng)質(zhì)譜檢測，rHWTX-Ⅰ的分子量和天然HWTX-Ⅰ一樣，都為3750.6