虎紋捕鳥蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表達.pdf

1、研究背景:
　　 虎紋捕鳥蛛是我國特有的大型有毒蜘蛛。HWTX-Ⅺ(虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅺ)是從虎紋捕鳥蛛粗毒中提取的一種Kunitz型多肽毒素，具有很強的胰蛋白酶抑制作用，研究表明可用于治療急性胰腺炎，但它同時具有阻斷鉀離子通道的作用，在動物身上表現(xiàn)出較弱的神經(jīng)毒性。其胰蛋白酶抑制活性和鉀離子通道阻斷活性的功能區(qū)域相互獨立，非常有利于毒素改造。HW11c40是從虎紋捕鳥蛛毒腺中克隆到的一種新型基因，它所編碼的Kunitz型多肽毒素

2、和HWTX-Ⅺ具有相似的空間結構以及胰蛋白酶抑制關鍵活性殘基K14，但其不具有鉀離子通道抑制的關鍵活性殘基R25。推測，HW11c40和HWTX-Ⅺ一樣具有強大的胰蛋白酶抑制活性，而其鉀離子通道阻斷活性會更低。有希望通過對HW11c40進行基因改造，消除其鉀離子通道阻斷活性，研制出治療急性胰腺炎的高效藥物。然而從天然毒液中分離的蜘蛛毒素遠遠不能滿足研究和開發(fā)的需要，蜘蛛毒素的獲取一直是限制其研究的難題。目前，通過基因工程表達蜘蛛毒素是一

3、種有效的人工獲取毒素的方法。
　　 研究目的:
　　 1、探索出適合HWTX-Ⅺ表達的表達系統(tǒng)，解決HWTX-Ⅺ研究來源問題。
　　 2、對HW11 c40進行分子改造，以期消除神經(jīng)毒副作用，提高多肽穩(wěn)定性，獲得專一高效的胰蛋白酶抑制劑。找到適合HW11c40突變體表達的表達系統(tǒng)，為篩選出合適的突變體進而研制出高效的治療急性胰腺炎及其胰蛋白酶相關性藥物奠定基礎。
　　 研究方法
　　 1、PCR克

4、隆出HWTX-Ⅺ的片段重組到載體pET-40b(+)中，構建出重組載體，將重組載體轉入至大腸桿菌BL21(DE3)進行周質表達，獲得HWTX-Ⅺ的融合蛋白，通過腸激酶酶切融合蛋白釋放出HWTX-Ⅺ的目的蛋白、再經(jīng)鎳柱和色譜進一步分離純化、最終用質譜鑒定。并對表達的條件進行了優(yōu)化。
　　 2、通過PCR定點突變法對HW11c40進行分子改造后，分別轉入載體pVT102U/a和pET40b(+)中，構建出其四個突變體[Y35C]、[

5、Y35CD39N]、[RLY56(35) LEC]及[RLY56(10)(35) LETC]的重組載體，再分別通過釀酒酵母S78真核表達系統(tǒng)和大腸桿菌BL21(DE3)原核周質表達系統(tǒng)中進行表達，接著進行分離純化，最終用質譜鑒定。
　　 研究結果:
　　 1、原核周質表達系統(tǒng)表達出了HWTX-Ⅺ融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切成功釋放出目的蛋白，再經(jīng)質譜鑒定驗證其表達成功，樣品凍干后最高量達3.4mg/L。HWTX-Ⅺ最優(yōu)表達條件

6、是無IPTG誘導，30度，培養(yǎng)15-20小時。
　　 2、對HW11c40進行了成功的突變，并構建出相應的突變體重組載體。釀酒酵母S78真核表達系統(tǒng)只表達出HW11c40的一種突變體[Y35CD39N](HW11c40M2)。BL21(DE3)原核周質表達系統(tǒng)表達出了所有的突變體的融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切后，Trince SDS PAGE鑒定證實都獲得了對應的目的蛋白。其中[Y35C](KpnIHW11c40M1)又經(jīng)進一步的分離

7、純化和質譜鑒定，驗證其獲得表達。
　　 研究結論:
　　 1、首次用該原核周質表達系統(tǒng)高效表達出HWTX-Ⅺ，并對表達條件進行了優(yōu)化，探索出HWTX-Ⅺ表達的新途徑。
　　 2、對HW11c40成功的進行了分子改造，并用原核周質表達系統(tǒng)表達出了以增強多肽穩(wěn)定性，降低鉀離子通道阻斷活性，提高胰蛋白酶抑制活性為目的HW11c40的4種突變體多肽毒素，證實此原核周質表達是適合的表達系統(tǒng)。為后期活性研究，篩選出有意義的突