子宮頸癌細胞中Src對ERK信號通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與信號通路中相關(guān)因子的異常表達有關(guān)。Src作為重要的信號因子，在多種組織類型的人類實體瘤中被激活和（或）蛋白表達過量。有研究表明， p-Src在子宮頸癌組織及細胞系中過度表達，并影響著疾病的進展和預后。ERK信號通路廣泛參與調(diào)控腫瘤細胞的多種生物學功能，但在子宮頸癌細胞中Src對ERK信號通路的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本次研究采用體外細胞實驗的方法，以ERK信號通路關(guān)鍵因子Src、ERK1/2、c-Fos、

2、c-Jun以及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子hnRNP E1作為靶點，施加Src抑制劑干預，檢測Src對其表達的影響及其與子宮頸癌細胞的關(guān)系，以此綜合評價Src對子宮頸癌細胞中ERK信號通路的調(diào)節(jié)作用，為深入了解和認識子宮頸病變過程并尋找可能的干預途徑提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取子宮頸癌Hela細胞（HPV+）和C33A細胞（HPV-）進行實驗研究。采用PP2對兩種細胞的Src激酶施加干預，確定PP2的最佳抑制濃度（IC50）和抑制

3、時點。設(shè)立Src抑制前組為對照組，Src抑制后組為實驗組。采用活細胞計數(shù)法和CCK-8法測定抑制前后兩種細胞的生長情況和細胞活性，行流式細胞術(shù)檢測各組細胞的周期和及凋亡情況，分別采用Real-time PCR和Western-blot法檢測Src、ERK1/2、c-Fos、c-Jun、hnRNP E1的mRNA及蛋白表達水平。數(shù)據(jù)的錄入和分析由SPSS17.0軟件執(zhí)行。
　　結(jié)果：
　　1. PP2抑制效果的評價：（1）最佳

4、抑制條件：傳代后24h，20μM的PP2作用于Hela細胞，傳代后24h，12μM的PP2作用于C33A細胞。（2）PP2抑制效果的評價：PP2明顯下調(diào)了兩種子宮頸癌細胞的p-Src蛋白水平，說明采用以上抑制條件，很好地達到了抑制效果。其中，Hela細胞的p-Src蛋白較抑制前下降了28.87％（t=4.547,P=0.045），C33A細胞的p-Src蛋白較抑制前下降了33.33%（t=5.354, P=0.033）。同時，Hela細

5、胞的Src蛋白降低了33.56%（t=1.662, P=0.238），C33A細胞的Src蛋白降低了29.47%（t=3.233, P=0.082）。經(jīng)比較，p-Src蛋白和Src蛋白抑制前后的降低值在C33A和Hela間無統(tǒng)計學差異（t=-0.139, P=0.893;t=-1.869, P=0.099）。（3）Src抑制后，兩種子宮頸癌細胞的Src mRNA含量較抑制前升高（ t=-1.137, P=0.306;t=-18.403,

6、 P=0.003），且Hela細胞的Src mRNA升高值顯著大于C33A細胞（t=13.909, P<0.001）。
　　2．Src對子宮頸癌細胞一般生物學特性的影響:（1）Src影響細胞活性。Src抑制前，C33A細胞和Hela細胞迅速繁殖，C33A的生長速度慢于Hela。Src抑制后，兩種細胞生長速度變慢，活細胞數(shù)大量減少（P<0.001），最佳抑制條件下，各時點的PP2對C33A細胞和Hela細胞的抑制程度相似（P>0.0

7、5）。（2）Src影響周期的轉(zhuǎn)變。Src抑制后，C33A細胞和Hela細胞G0/G1期的比例分別升高了24.04%（t=6.101, P=0.004）和30.90%（t=-15.155, P<0.001）；S期的比例分別降低了24.46%（t=-5.842, P=0.013）和17.35%（t=13.384, P=0.001）；C33A的G2/M降低了13.20%（t=-1.317, P=0.258），Hela的G2/M降低了32.75

8、%（t=6.103, P=0.001）。僅見Hela的G2/M期對于PP2的反應(yīng)程度大于C33A（t=4.614, P=0.002）。（3）Src具有促增殖抑凋亡的作用。Src抑制后，C33A的增殖指數(shù)（PI）降低了22.64%（t=-6.101, P=0.004），Hela的PI降低了20.89%（t=14.941, P<0.001）。Src抑制前后，C33A的凋亡指數(shù)（AI）（6.90±1.50）%和（43.04±0.33）%均大于

9、Hela的（3.74±1.11）%和（14.50±1.86）%。經(jīng)比較， Src抑制前后， PI的降低值在Hela和C33A間無統(tǒng)計學差異（ t=1.613, P=0.145），而Hela細胞的AI的升高值遠低于C33A細胞（t=25.834, P<0.001）。
　　3．子宮頸癌細胞中Src對ERK1/2、c-Jun、c-Fos、hnRNP E1基因表達的影響：（1）Src抑制后，Hela和C33A的ERK1、ERK2、c-Fo

10、s、c-Jun的mRNA含量較抑制前顯著升高（P<0.05），hnRNP E1 mRNA含量較抑制前顯著降低（P<0.05）。經(jīng)比較，抑制前后ERK1、c-Fos、c-Jun的mRNA在Hela中的升高值均顯著大于C33A（P<0.05）。（2）Src抑制后，Hela和C33A中的p-Src蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量較抑制前顯著降低（P<0.05），c-Jun蛋白和p-c-

11、Jun蛋白含量較抑制前顯著升高。經(jīng)比較，抑制前后p-Src蛋白、p-ERK1/2蛋白和c-Fos蛋白含量在C33A的降低值大于Hela，而其c-Jun和p-c-Jun蛋白含量的升高值卻低于Hela，p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量的降低值在C33A和Hela間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. PP2作用于Src激酶的磷酸化，即可明顯下調(diào)兩種子宮頸癌細胞的p-Src蛋白含量。Src抑制后，兩種子

12、宮頸癌細胞的Src mRNA相對含量升高，提示在基因的轉(zhuǎn)錄水平可能存在維穩(wěn)機制或其他信號因子參與調(diào)控Src基因的表達。結(jié)合Src抑制前后，Src mRNA在HPV陽性的Hela細胞中的升高值大于HPV陰性的C33A細胞，而Hela的p-Src蛋白含量的降低值小于C33A的結(jié)果，提示Src可能受HPV誘導而激活。
　　2. Src可促進子宮頸癌細胞的惡性轉(zhuǎn)變。Src干預后，C33A和Hela的細胞活性降低，G0/G1期所占比例升高，

13、S和G2/M比例下降，PI降低，AI上升，提示子宮頸癌細胞的惡性轉(zhuǎn)變與Src激酶的活性呈正相關(guān)，Src活化可加速G0/G1向S期的轉(zhuǎn)變，為腫瘤細胞的惡性增殖提供先決條件，提示Src可作為子宮頸癌治療的潛在靶點。
　　3. Src可影響ERK信號通路關(guān)鍵因子及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達。Src抑制后，C33A細胞和Hela細胞的ERK1、ERK2、c-Jun和c-Fos基因的mRNA含量升高，hnRNP E1 mRNA含量降低，p-Src

14、蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量降低。提示Src參與調(diào)控ERK信號通路一系列關(guān)鍵因子以及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達（效應(yīng)蛋白水平作用更顯著），促進子宮頸癌變的進展。相關(guān)信號因子的mRNA水平在Src抑制后出現(xiàn)上調(diào)可能與磷酸化的效應(yīng)蛋白含量降低后觸發(fā)了多環(huán)節(jié)的負反饋調(diào)控作用有關(guān)。Src抑制后，c-Jun基因區(qū)別于c-Fos基因的變化趨勢，出現(xiàn)了mRNA和蛋白水平的雙提升，揭示了ERK信號

15、通路的復雜性。
　　4.經(jīng)比較，Src抑制前后，HPV陰性的C33A細胞的PI降低值與HPV陽性的Hela細胞水平相當，而 C33A的AI的升高值遠大于Hela，且C33A細胞的p-Src蛋白、p-ERK1/2蛋白、c-Fos蛋白含量的降低值也顯著大于Hela細胞，進一步提示， Src活化與HPV感染可協(xié)同調(diào)控ERK信號通路中一系列關(guān)鍵因子的表達，促進子宮頸癌變的進展。要想證實HPV感染確實在這一過程中發(fā)揮作用，需要在同種細胞中，