兔尿源性干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、細(xì)胞基礎(chǔ)療法為尿道組織重建提供了有前景的選擇。有研究發(fā)現(xiàn)人尿液中存在著一種干細(xì)胞，后被定義為尿源性干細(xì)胞(USCs)，這種干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，遺傳穩(wěn)定性好，并可有效分化為尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，且尿源性干細(xì)胞的獲取簡便、無創(chuàng)、成本低廉，這些優(yōu)點為尿路的組織工程重建提供了理想的種子細(xì)胞。在相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)USCs能促進(jìn)無胸腺裸鼠腎臟、陰莖海綿體及尿道括約肌等組織的再生。然而，因小鼠體型過小，并不適宜作為尿道重建研究的動物模型。通

2、過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，新西蘭大白兔是研究尿道重建的常用動物模型。為避免因異種細(xì)胞移植引起排斥反應(yīng)的發(fā)生，因此有必要采用自體干細(xì)胞進(jìn)行尿道組織重建研究。然而兔尿液中是否存在干細(xì)胞，且能否進(jìn)行分離后培養(yǎng)，目前還沒有相應(yīng)的研究報告。
　　目的:證實兔尿液中存在尿源性干細(xì)胞(rabbit Urine-derived Stem Cells，rUSCs)，并誘導(dǎo)其分化為尿路上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，為后續(xù)下尿路組織重建的研究提供種子細(xì)胞。
　　方

3、法:通過采用F8雙腔導(dǎo)尿管導(dǎo)尿術(shù)收集6只成年雄性新西蘭大白兔（體重介于2.0～2.5kg）尿液。采用離心分離法分離尿源性干細(xì)胞，經(jīng)貼壁篩選法純化細(xì)胞，KSFM和EFM混合培養(yǎng)基外體培養(yǎng)擴(kuò)增。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);繪制細(xì)胞生長曲線;測定細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型;并誘導(dǎo)其向尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化。
　　結(jié)果:從14份兔子尿液樣本中，成功的分離并培養(yǎng)出尿源性干細(xì)胞，每30ml兔子尿液中約有1～2個細(xì)胞克隆，在形態(tài)上r

4、USCs呈“米粒狀”。rUSCs的細(xì)胞倍增數(shù)量(PD)和平均倍增時間(DT)分別是48.5±6.2和（25.7±8.4）h;單個rUSC克隆在(51.6±0.5)天內(nèi)可增殖至4×1014個細(xì)胞(248.5=3.98×1014);細(xì)胞生長曲線呈正常的細(xì)胞增殖模型——“S”型;流式細(xì)胞檢測顯示，rUSCs在p3時CD29，CD90和CD105呈陽性表達(dá)，而CD31、CD34和CD45表達(dá)呈陰性;當(dāng)誘導(dǎo)表皮生長因子(EGF)加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，r

5、USCs可誘導(dǎo)分化為“鵝卵石”樣的細(xì)胞，特異性表達(dá)上皮細(xì)胞蛋白，如AE1/AE3;當(dāng)誘導(dǎo)平滑肌分化的生長因子TGF-β1和PDGF-BB加入培養(yǎng)基培養(yǎng)時，rUSCs分化為“紡錘狀”樣的細(xì)胞，表達(dá)平滑肌特異蛋白，如α-SMA、Desmin和Myosin。
　　結(jié)論:根據(jù)課題組初步的實驗數(shù)據(jù)分析顯示，兔尿液中存在USCs，且易于在體外分離和培養(yǎng)，并擁具有很強(qiáng)的增殖能力，能夠被誘導(dǎo)分化為尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。因此，rUSCs在兔子模