長(zhǎng)蠹科和長(zhǎng)小蠹科昆蟲(chóng)PCR-RDB鑒定技術(shù)及其分子系統(tǒng)進(jìn)化研究.pdf

1、鞘翅目Coleoptera長(zhǎng)蠹科Bostriychidae和長(zhǎng)小蠹科Platypodidae昆蟲(chóng)是一類具有經(jīng)濟(jì)意義的害蟲(chóng)，其食性復(fù)雜，鉆蛀力強(qiáng)，具有較大的破壞性，能危害木材、藤枝、竹枝及其制品、樹(shù)木、經(jīng)濟(jì)作物和糧食及樓宇結(jié)構(gòu)等。上述兩科昆蟲(chóng)主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，隨著國(guó)際貿(mào)易的快速增長(zhǎng)，加速了其傳播擴(kuò)散。我國(guó)口岸檢疫部門在進(jìn)口的原木、木材及包裝材料上多次截獲到長(zhǎng)蠹科和長(zhǎng)小蠹科害蟲(chóng)。為了防止外來(lái)物種入侵給我國(guó)林木造成重大經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)

2、將多種屬的長(zhǎng)蠹、長(zhǎng)小蠹列為植物檢疫性有害生物。由于檢疫截獲的蟲(chóng)體中存在大量的幼蟲(chóng)和蛹，其形態(tài)特征不明顯，難以進(jìn)行種類鑒定，同時(shí)木材害蟲(chóng)近緣種多，準(zhǔn)確的形態(tài)鑒定需具備專業(yè)知識(shí)和鑒定經(jīng)驗(yàn)，物種個(gè)體差異也常常導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究旨在應(yīng)用一種新型分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)解決這些問(wèn)題。
　　 反向斑點(diǎn)雜交(Reversed dot blot，RDB)是一種基于PCR基礎(chǔ)之上的雜交技術(shù)，特異探針和目標(biāo)基因PCR產(chǎn)物結(jié)合，通過(guò)類似酶聯(lián)免疫的方法

3、將雜交信號(hào)放大顯示出來(lái)。具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性和重復(fù)性好以及一次能檢測(cè)鑒定多個(gè)物種等技術(shù)特點(diǎn)。RDB技術(shù)已在醫(yī)學(xué)檢測(cè)和基因分型等領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用，但還未應(yīng)用到昆蟲(chóng)檢疫和鑒定中，檢測(cè)技術(shù)具有創(chuàng)新性。
　　 本研究選擇線粒體COⅠ基因作為研究目標(biāo)基因，通過(guò)PCR、克隆和測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，獲得長(zhǎng)蠹科、長(zhǎng)小蠹科等22種昆蟲(chóng)COⅠ基因序列。同時(shí)應(yīng)用PCR-RDB技術(shù)，分別建立了長(zhǎng)蠹科、長(zhǎng)小蠹科昆蟲(chóng)RDB種類檢測(cè)鑒定方法。昆

4、蟲(chóng)PCR-RDB檢測(cè)在一小張Biodyne C尼龍膜上進(jìn)行，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列，人工在膜上點(diǎn)上質(zhì)控探針(顯色點(diǎn)探針、陽(yáng)性探針、陰性探針)和檢測(cè)探針，通過(guò)PCR、雜交、顯色和掃描等步驟以及質(zhì)控探針和檢測(cè)探針的顏色變化來(lái)判定目標(biāo)害蟲(chóng)的種類。
　　 PCR-RDB昆蟲(chóng)檢測(cè)反應(yīng)體系包括15-20pmol/μL探針濃度、42℃雜交3h，DNA模板100pg以上。共篩選出21條木材害蟲(chóng)RDB種類鑒定特異探針，可實(shí)現(xiàn)9種長(zhǎng)蠹、9種長(zhǎng)小蠹及3種

5、小蠹昆蟲(chóng)的種類鑒定；RDB靈敏度檢測(cè)能達(dá)到pg級(jí)。
　　 本研究還重點(diǎn)研究了長(zhǎng)小蠹科5屬10種及長(zhǎng)蠹科4屬9種mtDNA COⅠ基因部分序列(GenBank序列號(hào)GQ895744～GQ895760，HM002618～HM002631)。采用MEGA3.1分析了序列組成及遺傳距離，應(yīng)用PAUP4.0分別構(gòu)建了長(zhǎng)蠹科和長(zhǎng)小蠹科NJ、MP及ML等三種分子系統(tǒng)樹(shù)，同時(shí)結(jié)合形態(tài)分類，探討各物種及所在屬的系統(tǒng)進(jìn)化。結(jié)果表明：長(zhǎng)小蠹科昆蟲(chóng)在堿

6、基使用頻率上有很大的偏向性，A+T含量高達(dá)68.3％；長(zhǎng)小蠹科與外群之間的遺傳距離(0.288～0.338)遠(yuǎn)大于科內(nèi)種間距離(0～0.226)；Diapus屬分化最早，Euplatypus屬獨(dú)成一支，Treptohlatypus，Dinoplatypus和Platypus三屬分化為一支。長(zhǎng)蠹科與外群之間的遺傳距離(0.229～0.348)遠(yuǎn)大于科內(nèi)種間距離(0～0.259)；Xylothrips屬位于系統(tǒng)樹(shù)的一支；其余種為一大支，在這