皮蠹科DNA條碼分類技術(shù)研究.pdf

1、皮蠹科（Dermestidae）隸屬鞘翅目（Coleoptera）皮蠹總科（Dermestoidea），是一類重要的儲(chǔ)藏物害蟲，食性雜、繁殖力強(qiáng)，危害嚴(yán)重。皮蠹科廣泛分布于世界各地，目前全世界已知1000多種，我國(guó)約有100余種。種類準(zhǔn)確識(shí)別鑒定是害蟲防治的基礎(chǔ)，皮蠹科分類以成蟲形態(tài)研究為主，幼蟲形態(tài)相似較難區(qū)別，由于形態(tài)研究對(duì)鑒定人員的分類知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，實(shí)際工作中種類鑒定困難較大。近年來，快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為昆蟲種類的快速

2、鑒定提供了新的方法，但皮蠹科昆蟲的分子生物學(xué)研究仍處于初步階段，且目前的分子研究多集中于斑皮蠹屬（Trogoderma），也未有針對(duì)皮蠹科內(nèi)相關(guān)屬之間系統(tǒng)的分子進(jìn)化研究。
　　本文為首次利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)皮蠹科倉(cāng)儲(chǔ)害蟲進(jìn)行分類研究。從DNA提取方法、PCR體系擴(kuò)增進(jìn)行試驗(yàn)探索，構(gòu)建皮蠹科分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，初步建立起皮蠹科基因條形碼數(shù)據(jù)庫，以期利用DNA條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)皮蠹科害蟲的快速分類鑒定。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括：
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3、．研究皮蠹科形態(tài)分類，分析重要種類的鑒定特征，攝取各種的背、腹、側(cè)面高清圖輔助鑒定。
　　2．優(yōu)化DNA提取方法，探索了不同預(yù)處理方法對(duì)DNA提取效果的影響。經(jīng)過預(yù)處理后，一定程度上減少了基因組DNA的斷鏈，DNA更易擴(kuò)增長(zhǎng)片段，且不同位點(diǎn)擴(kuò)增效果也較好，其中以9％NaCl溶液3h預(yù)處理后的昆蟲標(biāo)本，利用磁珠法所提DNA的質(zhì)量及PCR擴(kuò)增效果最佳。
　　3．建立適宜的PCR擴(kuò)增體系。反應(yīng)體系中加入牛血清蛋白并增加 Mg2+濃

4、度，能提高PCR擴(kuò)增效率及條帶質(zhì)量。設(shè)計(jì)的4對(duì)外圍巢式引物以A5/A6擴(kuò)增效果最優(yōu)，最佳退火溫度為49℃?；谛蛄蟹治鼋⒌?對(duì)巢式PCR組合，均能適用于較低濃度DNA擴(kuò)增。
　　4．COⅠ基因（細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因）序列分析。所獲皮蠹科COⅠ基因擴(kuò)增序列為前端357bp及后端609bp片段，分別進(jìn)行拼接校正、比對(duì)，利用MEGA分析了各序列保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)、各數(shù)據(jù)組堿基組成、堿基頻率、氨基酸組成、密

5、碼子使用情況，計(jì)算各物種間的遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)差，轉(zhuǎn)換與顛換比例。并對(duì)序列數(shù)據(jù)組系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)序列非隨機(jī)數(shù)據(jù)，可為下一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹提供依據(jù)保證。
　　5．系統(tǒng)發(fā)育研究。采用最大簡(jiǎn)約法（MP）、最大似然法（ML）兩種建樹方法，對(duì)皮蠹科COⅠ前、后兩端序列組及其翻譯的氨基酸進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。皮蠹科COⅠ基因后端序列片段所包含遺傳信息更豐富，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹較少發(fā)生偏離，同形態(tài)分類的一致性高于前端片段，更適于作為皮蠹