FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見(jiàn)的高致死率惡性腫瘤，也是我國(guó)最主要的公共健康問(wèn)題之一。雖然目前在針對(duì)HCC的早期篩查、診斷、手術(shù)技術(shù)等方面取得了明顯進(jìn)步，并顯著延長(zhǎng)了HCC患者的生存時(shí)間和改善了生存質(zhì)量，但是HCC的高轉(zhuǎn)移率和術(shù)后高復(fù)發(fā)率始終限制著總體生存率的提高。如何有效防治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為迸一步改善HCC患者生存預(yù)后的關(guān)鍵問(wèn)題?；蚪M突變和重組是HCC獲得

2、更強(qiáng)異質(zhì)性以及包含干細(xì)胞特性、高度耐藥性等惡性能力的原始動(dòng)力，在增強(qiáng)HCC細(xì)胞生存能力中起重要作用。全面解讀HCC腫瘤基因組發(fā)生的突變、結(jié)構(gòu)異常、染色體重構(gòu)以及拷貝數(shù)變異等信息可為揭示HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究提供重要線索，并促進(jìn)早診分子標(biāo)記物與精準(zhǔn)治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。
　　目的:
　　本研究旨在借助高通量RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)HCC組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的解讀，尋找與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵癌基因。擴(kuò)大樣本重點(diǎn)驗(yàn)證候選

3、癌基因FAM83D在HCC患者中的表達(dá)模式以及臨床意義。體外構(gòu)建FAM83D敲減細(xì)胞株，明確FAM83D在維持HCC細(xì)胞干性中的作用。最后，借助基因芯片和蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)闡明FAM83D調(diào)控HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.通過(guò)高通量RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析篩選HCC組織與相應(yīng)癌旁組織間的差異表達(dá)基因。
　　2.收集150對(duì)HCC患者腫瘤組織、配對(duì)癌旁組織以及臨床病理信息，利用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒

4、光定量PCR等方法驗(yàn)證候選基因FAM83D在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)模式，分析FAM83D在HCC組織中的表達(dá)水平與患者腫瘤病理參數(shù)、生存預(yù)后之間的相關(guān)性。
　　3.通過(guò)體外轉(zhuǎn)染FAM83D-siRNA慢病毒構(gòu)建FAM83D敲減HCC細(xì)胞株，借助懸浮球細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀表面蛋白表達(dá)量分析實(shí)驗(yàn)、Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM83D對(duì)HCC細(xì)胞干性能力、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增的影響;利用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)和

5、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察FAM83D對(duì)HCC細(xì)胞成瘤、轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.降低HCC細(xì)胞株FAM83D表達(dá)后，利用轉(zhuǎn)錄組基因芯片實(shí)驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，通過(guò)GO和KEGG分析初步探索FAM83D參與HCC細(xì)胞干性調(diào)控的潛在分子機(jī)制。
　　5.通過(guò)信號(hào)通路小分子抑制劑抑制實(shí)驗(yàn)和CD44-siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD44與MAPK、TGF-β以及Hippo通路之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，利用蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析明確FAM83D調(diào)

6、控上述信號(hào)通路的關(guān)鍵上游分子。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)對(duì)10對(duì)HCC樣本患者的高通量RNA測(cè)序，共篩選得到HCC組織及癌旁組織間差異表達(dá)基因544個(gè)（倍數(shù)改變＞2，P＜0.01），其中321個(gè)過(guò)表達(dá)基因，223個(gè)為低表達(dá)基因。FAM83D在9對(duì)HCC樣本中表達(dá)水平顯著增高，平均表達(dá)增高倍數(shù)超過(guò)8倍。
　　2.在擴(kuò)大驗(yàn)證的150對(duì)HCC樣本中，qRT-PCR和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FAM83D在HCC組織中的表達(dá)水平

7、顯著高于配對(duì)癌旁組織(P＜0.01)。高表達(dá)FAM83D與HCC患者惡性腫瘤生物學(xué)特征正相關(guān)，如腫瘤低分化、血清高AFP水平、門(mén)靜脈侵犯、腫瘤數(shù)目＞3等。與FAM83D低表達(dá)組相比，F(xiàn)AM83D高表達(dá)患者擁有更高的肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率和更短的無(wú)瘤生存時(shí)間。
　　3.體外細(xì)胞干性實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCC細(xì)胞株敲減FAM83D后，顯著抑制了CD44s和CD44v分子的表達(dá)以及懸浮球形成能力。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)FAM83D后可顯著抑制HCC細(xì)胞

8、株的成瘤能力、腫瘤轉(zhuǎn)移能力以及肺克隆能力。
　　4.轉(zhuǎn)錄組基因芯片結(jié)果提示FAM83D下調(diào)后可引起1565個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)（倍數(shù)＞2，P＜0.01），主要分布于MAPK、TGF-β以及Hippo等信號(hào)通路。敲減FAM83D表達(dá)后，ERK1/2、Smad2磷酸化水平下降，YAP表達(dá)水平受到抑制，YAP磷酸化水平相對(duì)增高。
　　5.MAPK、TGF-β以及Hippo信號(hào)通路抑制后，可顯著下調(diào)CD44分子的表達(dá);干擾CD44表達(dá)

9、后，ERK1/2、Smad2磷酸化、YAP表達(dá)水平下降，YAP磷酸化水平相對(duì)增高，提示CD44與上述信號(hào)通路存在互相調(diào)節(jié)作用。
　　6.蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)RAP1為FAM83D調(diào)控MAPK、TGF-β以及Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵上游分子。
　　結(jié)論:
　　1.相對(duì)于癌旁組織，F(xiàn)AM83D在HCC組織的表達(dá)水平明顯升高，并與惡性腫瘤生物學(xué)行為和不良預(yù)后相關(guān)。
　　2.敲減FAM83D可顯著抑制CD4