Galectin-3通過調(diào)控E-n-cadherin和CD44的表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　半乳糖凝集素(galectin)是凝集素超級(jí)家族的一個(gè)家族，屬于β-半乳糖苷連接蛋白，對(duì)β-半乳糖苷有高度親和性。迄今為止發(fā)現(xiàn)的半乳糖凝集素共有15種，并且都擁有一個(gè)或兩個(gè)高度保守的糖識(shí)別域(carbohydrate cognition domain，CRD)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是galectin家族中唯一的嵌合型代表，擁有一個(gè)CRD和一個(gè)串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域。Galectin-3(gal-3)廣泛表

2、達(dá)于正常組織與腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)合成，能夠穿梭于胞漿和胞核，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增值、遷移、凋亡、粘附和血管形成。Gal-3在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度存在著密切聯(lián)系。近年來(lái)的研究表明，多數(shù)腫瘤患者血清中g(shù)al-3的濃度明顯高于正常人，主要集中在乳腺癌、肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等患者。血清中的gal-3能夠使MUC1極化分布，將細(xì)胞表面的粘附分子(cell adhesion

3、molecules，CAMs)暴露出來(lái)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附。也有文獻(xiàn)報(bào)道，gal-3的表達(dá)可誘導(dǎo)整合素的活化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的纖連蛋白和層粘連蛋白的粘附。細(xì)胞粘附分子能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)能夠與同型的E-cadherin結(jié)合，起到維持上皮細(xì)胞極性和完整性的作用，并且還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的聚集，因此

4、被廣泛認(rèn)為是腫瘤抑制因子，具有抑制腫瘤遷移的作用。而N-鈣粘蛋白(E-cadherin)和CD44具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的作用，也能夠促進(jìn)腫瘤的遷移和與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附。尤其是N-cadherin的表達(dá)也能夠抑制E-cadherin調(diào)節(jié)的粘附作用，并且在引起腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著比E-cadherin的減少更為重要的作用。然而目前gal-3是否能夠調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和CD44等粘附分子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤

5、細(xì)胞的遷移？細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的gal-3對(duì)這些粘附分子的調(diào)控作用以及對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用有何不同？目前這些調(diào)控機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本論文選用表達(dá)gal-3的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和不表達(dá)gal-3的前列腺癌PC3細(xì)胞，分別研究細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外gal-3是否調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和CD44的表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和粘附，調(diào)控機(jī)制如何？選用的這兩種細(xì)胞均是MUC1低表達(dá)，從而避開MUC1對(duì)本論文中研究的ga

6、l-3調(diào)控粘附分子作用與機(jī)制的影響。
　　研究方法和結(jié)果
　　1.細(xì)胞內(nèi)gal-3對(duì)粘附分子的調(diào)控及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用
　　(1)采用siRNA技術(shù)干擾A549細(xì)胞內(nèi)gal-3的表達(dá)后，采用Western blotting方法檢測(cè)幾種粘附分子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin、N-cadherin和CD44三種粘附分子的表達(dá)均明顯降低，提示細(xì)胞內(nèi)gal-3能夠上調(diào)E-cadherin，N-cadherin和CD4

7、4的表達(dá)水平。(2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549的聚集情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)gal-3對(duì)A549的聚集無(wú)明顯影響。(3)采用siRNA技術(shù)干擾A549細(xì)胞gal-3的表達(dá)后，A549細(xì)胞與HUVECs之間的粘附能力明顯降低。提示細(xì)胞內(nèi)gal-3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞A549與HUVECs細(xì)胞間的粘附。采用siRNA技術(shù)為探討該作用的分子機(jī)制是否與β-catenin入核有關(guān)，通過胞漿、胞核分離提取法，并采用Western blotting檢測(cè)A549

8、細(xì)胞胞漿、胞核的β-catenin的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gal-3的siRNA組的β-catenin入核減少，提示細(xì)胞內(nèi)gal-3可促進(jìn)β-catenin入核。進(jìn)一步采用β-catenin抑制劑ICG-001來(lái)確證β-catenin入核是細(xì)胞內(nèi)gal-3促進(jìn)A549細(xì)胞與HUVECs間粘附的關(guān)鍵因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用ICG-001可抑制兩種細(xì)胞間的粘附，而在ICG-001存在下，干擾gal-3的基因表達(dá)后不再影響兩種細(xì)胞間的粘附。說(shuō)明gal-3可

9、能是通過促進(jìn)β-catenin入核調(diào)控粘附分子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控A549細(xì)胞與HUVECs間的粘附。(4)確定參與細(xì)胞內(nèi)gal-3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附作用的粘附分子種類及調(diào)控機(jī)制。上述結(jié)果已發(fā)現(xiàn)Gal-3可上調(diào)E-cadherin，N-cadherin和CD44的表達(dá)水平，那么三種粘附分子是否均參與了兩種細(xì)胞間的粘附作用呢？首先，檢測(cè)HUVECs細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HUVECs表達(dá)N-

10、cadherin，但不表達(dá)E-cadherin。E-cadherin和CD44的配體是同型的cadherin分子，而CD44的配體是透明質(zhì)酸，并且透明質(zhì)酸幾乎存在于所有細(xì)胞表面。提示gal-3促進(jìn)A549細(xì)胞與HUVECs細(xì)胞間的粘附作用與上調(diào)E-cadherin的表達(dá)無(wú)關(guān)，而是與N-cadherin和CD44相關(guān)。接下來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的gal-3與N-cadherin和CD44的調(diào)控關(guān)系。采用ICG-001阻斷β-catenin的下游通路

11、，并利用Western blotting方法檢測(cè)N-cadherin和CD44的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，ICG-001能夠使A549的N-cadherin的表達(dá)降低，但對(duì)CD44的表達(dá)無(wú)顯著影響。但是在ICG-001的存在下，細(xì)胞內(nèi)gal-3干擾后不再影響A549細(xì)胞中N-cadherin和CD44的表達(dá)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)gal-3是通過β-catenin入核上調(diào)N-cadherin和CD44的表達(dá)，從而促進(jìn)A549細(xì)胞與HUVECs之間的粘附作

12、用。(5)采用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)gal-3對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。本次試驗(yàn)分別觀察單用gal-3 siRNA或10μMβ-catenin抑制劑ICG-001組或兩者合用后A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。而gal-3干擾組中和β-catenin抑制劑ICG-001組A549細(xì)胞的遷移能力也明顯下降。兩者合用組A549細(xì)胞幾乎無(wú)明顯的遷移能力。提示，阻斷β-catenin/TCF基因轉(zhuǎn)錄能夠增強(qiáng)干擾gal

13、-3表達(dá)后抑制遷移的作用。促進(jìn)β-catenin入核是gal-3促遷移作用的重要機(jī)制之一。
　　2.細(xì)胞外的gal-3對(duì)粘附分子的調(diào)控及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　(1) Gal-3通過EGFR介導(dǎo)可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在EGF的存在下，細(xì)胞外的gal-3能夠持續(xù)性激活表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，并使E-cadherin的表達(dá)降低。本論文中我們進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞外gal-3調(diào)控E-cadher

14、in表達(dá)的機(jī)制。在PC3細(xì)胞中加入EGF和gal-3共孵育1h后，采用Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外gal-3可通過NF-κB相關(guān)信號(hào)通路下調(diào)PC3細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin的表達(dá)。(2)采用免疫共沉淀法檢測(cè)E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的變化，結(jié)果顯示細(xì)胞外gal-3能夠下調(diào)E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的形成。(3)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC3細(xì)胞的同型聚集情況，結(jié)

15、果顯示，在EGF的存在下，gal-3能夠抑制PC3的聚集。(4)胞外gal-3能進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，上調(diào)N-cadherin和CD44的表達(dá)，但不影響E-cadherin的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)是在無(wú)EGF的存在下，PC3細(xì)胞經(jīng)gal-3處理0、1、2、4、8h之后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)gal-3的表達(dá)水平，觀察細(xì)胞外的gal-3能否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);同時(shí)檢測(cè)對(duì)E/N-cadherin和CD44的表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2h時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的gal-3最多，之后逐漸下降。與此

16、同時(shí)，E-cadherin的表達(dá)沒有顯著的變化，而N-cadherin和CD44在8h的時(shí)候表達(dá)最高。由于之前檢測(cè)了HUVECs細(xì)胞并不表達(dá)E-cadherin，細(xì)胞外的gal-3調(diào)控腫瘤細(xì)胞與HUVECs之間的粘附無(wú)需E-cadherin的參與。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)便不再加入EGF。(5)檢測(cè)了細(xì)胞外的gal-3對(duì)A549和PC3細(xì)胞與HUVECs之間粘附的影響，結(jié)果顯示，外加人重組的gal-3能夠促進(jìn)A549和PC3細(xì)胞與HUVECs間的粘

17、附;同時(shí)能夠上調(diào)N-cadherin和CD44的表達(dá)。(6)為了驗(yàn)證細(xì)胞外的gal-3是否內(nèi)吞進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)并促進(jìn)β-catenin的入核，采用胞漿、胞核分離提取法和western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胞漿、胞核的gal-3和β-catenin的變化。結(jié)果顯示胞漿、胞核里的gal-3和β-catenin隨著加入的gal-3濃度的增加而增加，說(shuō)明細(xì)胞外的gal-3進(jìn)入到細(xì)胞里面，進(jìn)而促進(jìn)β-catenin入核，調(diào)控N-cadehrin和

18、CD44的表達(dá)。
　　最后進(jìn)一步確證了N-cadherin和CD44參與gal-3促進(jìn)的A549細(xì)胞與HUVECs間的粘附。采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)這兩個(gè)粘附分子的表達(dá)后，結(jié)果顯示N-cadherin表達(dá)的下調(diào)對(duì)A549細(xì)胞與HUVECs之間的粘附的影響大于CD44表達(dá)的下調(diào)所造成的影響。并且在這兩個(gè)粘附分子表達(dá)下調(diào)之后加入了gal-3，結(jié)果顯示干擾CD44組粘附能力恢復(fù)到接近空白對(duì)照組細(xì)胞的粘附能力。因此，N-cadherin

19、在gal-3誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與HUVECs之間的粘附中發(fā)揮了比CD44更重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.細(xì)胞內(nèi)的gal-3能夠增加β-catenin入核上調(diào)N-cadherin和CD44的表達(dá)，從而促進(jìn)A549細(xì)胞與HUVECs間的粘附。
　　2.細(xì)胞內(nèi)的gal-3對(duì)A549細(xì)胞間的同型聚集沒有顯著影響。
　　3.細(xì)胞內(nèi)的gal-3能夠增加β-catenin入核促進(jìn)A549細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　4.在

20、EGF的存在下，細(xì)胞外的gal-3能夠通過PI3K/P-Akt/NF-kB/ZEB1信號(hào)通路下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)N-cadherin的表達(dá)，從而抑制PC3細(xì)胞的同型聚集。
　　5.細(xì)胞外的gal-3能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過增加β-catenin入核促進(jìn)N-cadherin和CD44的表達(dá)，但并不影響E-cadherin的表達(dá)。
　　6.細(xì)胞外的gal-3能通過增加β-catenin入核促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與HUVEC