Amycolatopsis orientalisZEL-1的聚乙烯降解特性及其基于轉錄組測序的降解關鍵基因和代謝通路研究.pdf

1、為解決聚乙烯塑料在環(huán)境中難降解的問題，本研究篩選出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。經(jīng)篩選純化，對該菌進行生理生化實驗和16SrDNA序列分析;將菌株先后接種于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw＞100000)為唯一碳源的基礎液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng);每24小時，用分光光度法測定菌體生長濃度和胞外蛋白含量;培養(yǎng)60天后，稱取殘留PE重量，用掃描電子顯微鏡觀察膜片表觀，用拉力

2、測試機、水接觸角測定儀以及紅外光譜儀測定膜片性能。
　　為進一步提高原始菌株對高分子量PE的降解能力，本研究對原始菌株進行了誘變處理。采用紫外輻照、微波熱效應、LiCl、鹽酸羥胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法對菌株進行誘變;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度篩選法，對誘變菌株進行篩選;通過誘變菌株在以聚乙烯為唯一碳源的培養(yǎng)基中的菌體生長情況、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指標，選出降解性能最優(yōu)的菌株，再

3、將該菌株與原始菌株在相同培養(yǎng)條件下（以PE膜片為唯一碳源）培養(yǎng)60天，測定膜片力學性能。
　　為找出降解PE的關鍵基因和代謝通路，我們將原始菌株在不同碳源培養(yǎng)條件下的（G組:以可溶性淀粉為唯一碳源;W組:以PE為唯一碳源）基因表達情況進行轉錄組測序分析，經(jīng)RNA提取純化、建庫、測序、質(zhì)控等過程，再進行GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫注釋比對、聚類和富集分析;對兩個處理組的基因表達量進行差異比較;最后隨機選取差異基因進行RT-PCR表達

4、量驗證。
　　結果表明，篩選出的菌株為放線菌屬的東方擬無枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），命名為ZEL-1。該菌在分子量越低的聚乙烯培養(yǎng)液中，菌濃度、胞外蛋白含量、還原糖含量、聚乙烯失重率越高，菌液pH值下降得越快;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸強度降低74.15％，斷裂伸長率減少84.90％，力學性能顯著下降;水接觸角從78.58±0.10°變小到41.25±0.16°，親水性增大;紅外光

5、譜研究結果表明，膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
　　誘變育種結果表明，紫外輻照50s，微波誘變800Hz、120s，0.02％吖啶橙，0.7％LiCl，0.6％鹽酸羥胺，為各方法的最優(yōu)的誘變劑量。復合誘變采用紫外50s的突變菌株為出發(fā)菌株，再用0.02％吖啶橙誘變。PE培養(yǎng)基中菌體生長趨勢，除鹽酸羥胺組外，其他組均優(yōu)于原始菌株組;紫外組胞外蛋白含量較原始組平均提高2.06倍，微波組平均提高1.24倍，吖啶組平均提高

6、2.70倍，鹽酸羥胺組平均提高1.60倍，復合誘變組平均提高3.30倍;鹽酸羥胺組膜片失重率低于原始菌株組，其他組均高于原始菌株組，復合誘變組膜片失重率最大，高于原始組2.28倍;選擇復合誘變組菌株UV-AO-1為優(yōu)勢菌株，PE降解60天后，UV-AO-1組水接觸角比原始菌株組減小2.5°;拉伸強度減小3.37Mpa，斷裂伸長率減少39.62％。
　　轉錄組測序結果表明，此次共得到12372(63.24％)個非冗余Unigene，

7、其中2095條Unigene富集于代謝過程組中;與COG數(shù)據(jù)庫比對，有3328條Unigene與COG數(shù)據(jù)庫中的基因具有同源性;涉及到代謝活動相關的Unigene占50.57％;發(fā)現(xiàn)差異表達基因423個，與G組相比，W組有293個基因表達上調(diào)，130個基因下調(diào);AlkB基因差異表達最為顯著。與KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫比對，有5776條轉錄本比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中，有92個代謝通路出現(xiàn)差異;碳代謝、氨基酸合成、丙酮酸代謝途徑的差異基

8、因表達上調(diào)數(shù)量較多，乙酰-CoA合成、脂肪酸代謝的相關基因表達差異上調(diào)顯著，檸檬酸循環(huán)的差異基因下調(diào)明顯。
　　實時熒光定量PCR驗證結果表明，熒光定量PCR得出的表達量與轉錄組測序結果的差異基因表達量上下調(diào)模式基本一致，證明此次轉錄組數(shù)據(jù)結果可信。
　　綜上所述，本研究菌株ZEL-1能夠直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;誘變菌株UV-AO-1的降解性能優(yōu)于原始菌株，具有更大的應用潛力。原始菌株在PE碳源的培養(yǎng)條件下