量子點—生物分子復合探針的構建及其在生物分析中的應用.pdf

1、量子點是一種新型的半導體納米顆粒,是納米生物光子學重要的工具之一。量子點作為一種極具應用前景的信號探針,與傳統(tǒng)有機熒光染料相比,具有寬而有效的激發(fā)譜,窄而對稱的發(fā)射譜,高的熒光量子效率,優(yōu)異的光化學穩(wěn)定性,方便靈活的表面可修飾性,以及發(fā)射波長尺寸可調等優(yōu)點?；谶@些獨特的光學性質,結合先進的分析檢測技術和平臺,量子點在生物分析中的應用日益廣泛,包括細胞與組織標記、生物分子跟蹤與檢測、免疫反應分析等方面,并取得了許多重要成果。但是,縱觀量

2、子點在生物分析領域的應用,大部分的機理都是基于生物分子之間的特異性相互作用。因此,構建量子點.生物分子復合探針,使量子點具有特異性靶向作用的同時,保持其熒光強度和穩(wěn)定性,并且盡量減少其他生物分子的非特異性吸附,這對于量子點在生物領域的應用,起著尤為關鍵的作用。
　　隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術的發(fā)展,醫(yī)學檢測中要求化驗和檢驗的儀器具有更高靈敏度、更短檢測時間、更小體積、便攜化。而新近發(fā)展起來的生物芯片技術,即微流控芯片技術所具有的優(yōu)點能夠很好

3、地滿足這些要求。目前,微流控芯片主要應用于基因測序、蛋白質圖譜分析等高、精、尖領域。隨著微流控芯片技術的不斷成熟和制作成本的不斷降低,必將大規(guī)模地進入到常規(guī)醫(yī)學檢測領域,取代那些笨重而且操作復雜的化驗、檢驗設備,進而促進醫(yī)療水平的進步。然而,目前微流控芯片的檢測靈敏度和特異性仍然有待提高。
　　我們課題組在水相合成高性能量子點方面有很好的基礎,利用微波輔助水相量子點制備技術,制備了優(yōu)良性能的水分散性量子點?；谶@個優(yōu)勢,我們試圖開

4、展一些原創(chuàng)性、有實際意義的研究工作,將量子點信號探針和微流控芯片檢測平臺相結合,充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢,克服彼此的缺陷:即量子點優(yōu)異的熒光性能,有助于提高微流控芯片的檢測靈敏度,并擴大其應用范圍;微流控芯片技術的可控性、高通量,有利于提升量子點探針的標識能力。本文構建了一系列性能優(yōu)良的量子點.生物分子復合探針,并將這些復合探針用于微流控芯片,對生物分子進行檢測。具體研究內容如下:
　　1.構建了一種新型的微流控芯片檢測體系。
　

5、　這種微流控芯片是由PDMS片層和芯片基片組成。借助此微流控技術平臺,實現(xiàn)了生物分子在固相表面的固定組裝、識別、捕獲、檢測等一系列的生物反應過程。此芯片制作成本低,易于操作,可實現(xiàn)不同種類、不同濃度的生物分子在微流控芯片上的快速分析。與傳統(tǒng)的微陣列芯片相比,這種微流控芯片技術能夠更好地保持生物分子的活性,樣品消耗量很少,不需要昂貴的點樣儀,對環(huán)境也沒有嚴苛的要求,并且流體具有可控性,有利于提高生物分子之間的結合效率,提高檢測靈敏度和特異

6、性。
　　2.構建了量子點一親和素復合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質芯片。
　　基于靜電相互作用,將帶相反電荷的量子點和親和素自組裝,形成了量子點-親和素復合探針,并將這種納米生物復合探針作為信號探針,用于微流控蛋白質芯片,對腫瘤標志物進行檢測。通過實驗條件的不斷改進和優(yōu)化,克服了PDMS微通道和基片對蛋白質的非特異性吸附,減小了量子點對蛋白質的非特異性吸附,降低了芯片的背景信號,提高了量子點在芯片上的信號強度。實驗結果

7、表明,相對于傳統(tǒng)的熒光染料(FITC),采用量子點作為信號探針,無論是信號強度,信號穩(wěn)定性,還是檢測靈敏度,都有明顯的提高。這是首次將量子點引入到微流控蛋白質芯片中。量子點在微流控芯片上的優(yōu)異表現(xiàn),證實了我們所構建的檢測體系,充分地融合了量子點和微流控技術的優(yōu)勢,為蛋白質的檢測和分析提供了一個新穎而有效的途徑。
　　3.構建了量子點.免疫球蛋白復合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質芯片。
　　基于共價偶聯(lián)的機理,將量子點和免

8、疫球蛋白(羊抗鼠二抗)連接,形成了量子點-免疫球蛋白復合探針。詳細地探討了共價連接對量子點熒光強度和穩(wěn)定性的影響,制備得到了有效且穩(wěn)定的量子點生物探針。本文將這種量子點生物探針,用于微流控蛋白質芯片,采用夾心免疫分析法,實現(xiàn)了緩沖液和血清中腫瘤標志物的高特異性、高靈敏度檢測;采用反相免疫分析法,實現(xiàn)了混合樣品的多元檢測和多色成像。對于真實樣本和復雜樣本的有效檢測,預示著這種檢測體系在臨床檢測和蛋白質組學研究領域具有強大的應用潛力,為理論

9、研究向實際應用轉換提供了有利的技術支撐。
　　4.構建了量子點-DNA-生物素-鏈霉親和素復合探針,并將這種探針用于微流控蛋白質芯片。
　　本文提出了一種新型的以DNA作為“橋梁”的蛋白質在量子點表面可控組裝的策略。作為驗證實驗,我們設計并制備了量子點-DNA-生物素-鏈霉親和素(QD-DNA-biotin-STV)納米生物復合物。實驗表明,組裝得到的復合物具有很高的熒光強度、穩(wěn)定性,以及生物分子的活性。將這種量子點復合探針

10、作為信號探針,用于微流控蛋白質芯片,實現(xiàn)了腫瘤標志物的高特異性、高靈敏度檢測。檢測限達到50fM,比有機熒光染料的檢測限低4個數(shù)量級;比量子點.親和素復合探針的檢測限低一個數(shù)量級。這種組裝策略避免了對量子點和生物分子的破壞,非常溫和、可控、有效,具有很高的普適性,將在生化分析和臨床應用中有廣泛的應用前景。
　　5.構建了量子點-DNA復合探針,并將這種探針用于微流控DNA芯片。
　　基于配體交換的原理,巰基修飾的DNA部分取

11、代量子點表面的巰基配體,制備得到量子點-DNA復合探針。通過控制組裝條件,得到了不同組裝密度的量子點-DNA復合探針。構建了基于雙色量子點的FRET體系,實現(xiàn)了靶DNA均相檢測。首次將量子點-DNA探針應用于微流控DNA芯片,實現(xiàn)了靶DNA的非均相檢測。實現(xiàn)結果表明,檢測具有比較高的靈敏度,檢測限達到了50fM。除此之外,這種檢測體系能夠有效地區(qū)分完全互補序列、單堿基錯配、非互補序列,具有很強的特異性和選擇性,為DNA的檢測提供了一種全

12、新而有效的檢測途徑。
　　6.發(fā)展了一種基于量子點的葡萄糖非標記檢測法。
　　首先證實了過氧化氫對量子點的熒光淬滅效應。基于葡萄糖氧化酶對葡萄糖的氧化催化反應,伴隨有過氧化氫生成,因此通過監(jiān)測量子點熒光強度的變化,檢測葡萄糖的濃度。實驗表明,這種檢測方法對濃度為微摩爾/升到毫摩爾/升的葡萄糖都能有效地檢測,檢測限為1.8μM。另外,基于同樣的檢測原理,采用96孔板作為檢測平臺,實現(xiàn)了標準樣品和血液樣本中葡萄糖的檢測。檢測結果