5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是目前全球第二大致死性疾病且致殘率最高，給患者和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。溶栓療法一直是急性血管梗死的速效治療方法，但溶栓后所致的腦缺血再灌注損傷與腦缺血疾病的預(yù)后和后遺癥的形成和治療有密切關(guān)系，該問(wèn)題也日趨受到重視?，F(xiàn)有抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物種類(lèi)較少，亟需尋找更為有效的治療藥物。
　　5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)，是在羅丹寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步修飾合成的新型化合物，已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)。

2、前期的實(shí)驗(yàn)表明，RD-1能顯著對(duì)抗MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷毒性，可能通過(guò)改善線粒體功能障礙發(fā)揮抗帕金森病的腦保護(hù)作用。而線粒體功能障礙是多種神經(jīng)性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，也是腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的原因之一。因此推測(cè)是否RD-1也可能通過(guò)改善腦缺血再灌注損傷所致的線粒體功能障礙，從而發(fā)揮抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究的目的即:采用氧糖剝奪后復(fù)灌(OGD/R)模型模擬體外腦缺血再灌注損傷，進(jìn)而采用大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻(

3、MCAO)2h后復(fù)灌造成體內(nèi)急性腦缺血再灌注模型，觀察RD-1對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并從組織水平、細(xì)胞水平、分子水平等多層面探討RD-1的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷藥效學(xué)研究
　　1.在大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞上建立OGD/R模型，1、5及10μM的RD-1作用48h后可以顯著對(duì)抗Na2

4、S2O4誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性(P＜0.05)。
　　2.建立大鼠MCAO模型并2h后復(fù)灌，連續(xù)給藥14d后確認(rèn)藥效。RD-1可顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分(P＜0.05)，顯著縮短大鼠去除兩側(cè)前肢貼紙的時(shí)間(P＜0.05)，顯著改善MCAO損傷所致的大鼠精神狀態(tài)異常(P＜0.05)。在平衡桿實(shí)驗(yàn)中一定程度上縮短大鼠過(guò)桿總時(shí)間，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MCAO損傷對(duì)于大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力及學(xué)習(xí)記憶能力并無(wú)顯著影響。
　　3

5、.HE染色結(jié)果顯示，大鼠大腦在MCAO損傷14d后腦梗死體積顯著增加(P＜0.01);各給藥組經(jīng)過(guò)14d治療后能夠明顯降低腦梗死體積（P＜0.05）。
　　4.對(duì)MCAO大鼠大腦損傷側(cè)皮層NeuN陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，RD-1可顯著抑制MCAO大鼠的損傷側(cè)大腦皮層前肢感覺(jué)區(qū)神經(jīng)元的丟失(P＜0.01)。各組之間正常側(cè)大腦皮層前肢感覺(jué)區(qū)單位面積內(nèi)NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量無(wú)明顯變化。
　　第二部分 5-(4-羥基-3-甲

6、氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制研究
　　1.OGD/R損傷可誘導(dǎo)大鼠原代皮層神經(jīng)元內(nèi)活性氧大量生成(P＜0.001)，線粒體膜電位顯著下降(P＜0.001)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的鈣超載現(xiàn)象(P＜0.01);而RD-1可明顯減輕OGD/R造成的線粒體損傷，顯著抑制活性氧的過(guò)量生成(P＜0.001)，穩(wěn)定線粒體膜電位(P＜0.001)，并減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載（P＜0.05）。
　　2.OGD/R損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)

7、元中線粒體分裂蛋白DRP1無(wú)明顯變化，但線粒體融合蛋白OPA1的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)，RD-1給藥可顯著提高OPA1的表達(dá)(P＜0.05)。
　　3.對(duì)大鼠損傷側(cè)皮層組織蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，MCAO損傷14d后線粒體分裂蛋白DRP1、線粒體融合蛋白OPA1和MFN2均顯著下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，而RD-1各給藥組可顯著增加上述3個(gè)蛋白的表達(dá)水平，從而對(duì)抗MCAO損傷所致的線粒體分裂及融合障礙

8、。
　　4.MCAO損傷14d后大鼠損傷側(cè)皮層組織中線粒體自噬標(biāo)記蛋白Beclin1的表達(dá)明顯降低(P＜0.001)，且LC3-Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變比例降低(P＜0.001);RD-1可通過(guò)激活PINK1/Parkin通路和Nix通路，促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)線粒體自噬過(guò)程。
　　5.線粒體軸突轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD/R損傷引起線粒體軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，表現(xiàn)為順向轉(zhuǎn)運(yùn)減慢，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)加快(P＜0.001);RD-1可顯著加快線粒體的順向轉(zhuǎn)運(yùn)(P＜0

9、.001)，減慢逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(P＜0.001)。同時(shí)體內(nèi)外western blot實(shí)驗(yàn)均證明RD-1可改善損傷后線粒體順向轉(zhuǎn)運(yùn)單位復(fù)合物中驅(qū)動(dòng)蛋白KIF1B和受體蛋白Miro2的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.05)。
　　6.大鼠原代皮層神經(jīng)元囊泡釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在限定的同一時(shí)間段內(nèi)，OGD/R組釋放神經(jīng)遞質(zhì)顯著減少(P＜0.01)，表明OGD/R損傷引起突觸囊泡神經(jīng)遞質(zhì)釋放的障礙，RD-1可以顯著逆轉(zhuǎn)這一障礙(P＜0.05)。同時(shí)，

10、體內(nèi)外western blot實(shí)驗(yàn)均證明RD-1可改善損傷后突觸小體相關(guān)蛋白SNAP25和Complexin-1/2的表達(dá)(P＜0.05)。
　　7.大鼠原代皮層神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果表明，OGD/R損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡比率增加，RD-1給藥后可大幅降低凋亡水平。
　　8.體內(nèi)外Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示缺血再灌損傷可改變細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá):顯著降低Bcl-2蛋白的水平(P＜0.05)，升高Bax蛋白的表達(dá)（

11、P＜0.01），因而降低Bcl-2/Bax的比例(P＜0.05);RD-1在體外可明顯改善上述變化(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，抑制凋亡;在體內(nèi)RD-1雖對(duì)Bcl-2的表達(dá)變化無(wú)明顯影響，但可顯著降低Bax蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)，并提高Bcl-2/Bax的比例(P＜0.01)，抑制凋亡。
　　綜上，RD-1在體內(nèi)外腦缺血再灌注損傷模型中均表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可顯著改善缺血再灌所致的線粒體功能障礙，減輕