哈氏噬纖維菌吸附微晶纖維素的影響因素及纖維素結(jié)合蛋白的初步探究.pdf

1、哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是廣泛存在于自然界中的一類可徹底降解結(jié)晶纖維素的好氧細(xì)菌,在降解纖維素方面有著快速、徹底等特點(diǎn)。
　　 哈氏噬纖維菌降解纖維素的機(jī)制十分特殊,與真菌和厭氧細(xì)菌的纖維素降解機(jī)理明顯不同。哈氏噬纖維菌降解纖維素的首要條件是與纖維素的直接接觸。其菌體表面不存在纖維小體,也不分泌胞外纖維素酶。所編碼的絕大部分纖維素酶類都不含有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBMs),也不含有類似于纖維

2、小體中dockingdomain的結(jié)構(gòu)域。這些特點(diǎn)顯示哈氏噬纖維菌吸附降解結(jié)晶纖維素具有獨(dú)特性,此類研究目前在國(guó)內(nèi)外幾乎都是空白。
　　 為了揭示哈氏噬纖維菌的纖維素吸附機(jī)制,本文對(duì)影響其吸附纖維素的各種因素進(jìn)行了初步研究,并推測(cè)參與吸附的主要成分:包括菌體對(duì)不同底物吸附能力的比較,菌體代謝活性對(duì)纖維素吸附的影響,表面蛋白及多糖對(duì)吸附的影響,以及纖維素類似物對(duì)吸附的抑制作用等。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)哈氏噬纖維菌對(duì)結(jié)晶纖維素

3、的吸附具有很強(qiáng)的特異性,不受菌體代謝活性的影響,吸附作用也不受纖維二糖和羧甲基纖維素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制;而菌體表面蛋白與纖維素吸附密切相關(guān);多糖成分對(duì)吸附作用影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,哈氏噬纖維菌中可能存在有特異性的微晶纖維素吸附蛋白?；谶@些研究結(jié)果,本文開(kāi)展了哈氏噬纖維菌細(xì)胞表面與纖維素吸附相關(guān)的蛋白的進(jìn)一步研究。
　　 鑒于蛋白在吸附過(guò)程中的重要作用,本文通過(guò)直接提取的方法,尋找哈氏噬纖維菌中纖維素結(jié)合蛋白,這類蛋白的分離鑒定對(duì)于

4、研究哈氏噬纖維菌吸附纖維素的機(jī)理具有重要意義。經(jīng)SDS-PAGE分離吸附在微晶纖維素上的天然膜蛋白,并通過(guò)蛋白質(zhì)譜鑒定,總共得到13種哈氏噬纖維菌的纖維素結(jié)合蛋白,包括三種滑動(dòng)相關(guān)蛋白,五種假定蛋白,一種外膜脂蛋白,一種β-葡萄糖苷酶,一種ATP合成酶亞基,一種熱激蛋白GroEL以及一種肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶,并對(duì)這些蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)的分析,包括其信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等。
　　 為實(shí)現(xiàn)對(duì)哈氏噬纖維菌纖維素結(jié)合蛋白的功能性研究,基于

5、在大腸桿菌中難以獲得活性表達(dá),本文考慮構(gòu)建哈氏噬纖維菌表達(dá)體系,通過(guò)同源表達(dá)并分離純化纖維素結(jié)合蛋白,進(jìn)而開(kāi)展更深入的研究。由于哈氏噬纖維菌遺傳操作系統(tǒng)的不完善,本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的自主復(fù)制質(zhì)粒來(lái)建立哈氏噬纖維菌的表達(dá)體系。該質(zhì)粒以紅霉素為篩選標(biāo)記,以綠色熒光蛋白或β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因,實(shí)驗(yàn)證明了這種質(zhì)粒能在哈氏噬纖維菌中表達(dá)。同時(shí),比較幾種不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)蛋白表達(dá)的能力強(qiáng)弱,發(fā)現(xiàn)其中CHU_1284的啟動(dòng)子是最強(qiáng)的啟動(dòng)子。