生孢噬纖維菌JL-01降解纖維素特性的研究.pdf

1、生孢噬纖維菌是能夠降解纖維素的滑動細菌，對纖維素有著較強的降解作用，但是其纖維素降解特性一直缺乏深入的研究，本論文對生孢噬纖維菌JL—01的固液培養(yǎng)特性、發(fā)酵過程中pH值和糖含量變化的測定、酶活測定方法的總結、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和FPase的分離純化進一步闡明Sporocytophagasp．JL—01對纖維素的降解機制。實驗結果具體如下： 1．在生孢噬纖維菌JL—01濾紙纖維素固體平板培養(yǎng)的過程中，168小時發(fā)現(xiàn)濾紙已經(jīng)完全被分解

2、。在CF11纖維素粉固體平板培養(yǎng)的過程中，CF11纖維素粉在192小時幾乎被完全降解。濾紙纖維素液體培養(yǎng)的過程中，144小時濾紙完全被分解。無論是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，JL—01對濾紙的降解效果要好于SD—02。 2．Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在進行濾紙纖維素液體培養(yǎng)時，PH值都有上升的現(xiàn)象，并且發(fā)酵液中無還原糖的產(chǎn)生，而且發(fā)酵液總糖含量在不斷的增加，前兩種現(xiàn)象與纖維素霉菌發(fā)酵時是完全不同的，這說明

3、在Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在發(fā)酵過程中，可能是由于大量的堿性物質(zhì)的生成導致pH的上升，并且有可能存在著特殊的糖代謝途徑；在以葡萄糖為碳源液體發(fā)酵時，pH值都有下降的現(xiàn)象。綜合Sporocytophagasp．JL—01和SD—02在液體發(fā)酵的現(xiàn)象，說明兩株菌在分別以濾紙纖維素和葡萄糖為唯一碳源時，糖代謝的途徑也不相同，這樣造成了pH值上升和下降以及發(fā)酵液中還原糖檢測不到的現(xiàn)象。原因可能是因為碳源不同，菌體

4、所產(chǎn)的酶系也不同。 3．在FPase酶活測定過程中考察了酶液與緩沖液比例、酶解反應時間長短、pH大小、濾紙?zhí)幚砼c否對產(chǎn)生還原糖的影響，并且確定了酶液與緩沖液比例為1：1、反應時間為2小時、pH值為7、以處理過的濾紙為底物時可以檢測到FPase的酶活。由于方法的原因而未能檢測到還原糖的存在就說纖維素細菌不存在FPase是不科學的。并且在酶活的測定過程中發(fā)現(xiàn)CMCase最適pH值是5．0，F(xiàn)Pase的最適pH值是7．0，從酶學性質(zhì)上

5、來講，可以猜測Sporocytophagasp．JL—01纖維素酶系可能是由酸性纖維素酶和堿性纖維素酶共同組成的。 4．在Sporocytophagasp．JL—01最佳產(chǎn)FPase條件的優(yōu)化的過程中，從時間、接種量、溫度、pH值、搖床轉數(shù)五個因素對Sporocytophagasp．JL—01進行了最佳產(chǎn)FPase條件的優(yōu)化，旨在為后續(xù)的FPase分離純化工作提供充足的FPase粗樣，因為FPase酶活性的低值有可能是因為此胞外

6、酶含量極少的原因，優(yōu)化結果為接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7．2，搖床轉數(shù)為120r/min，培養(yǎng)時間120h，并按照此優(yōu)化結果進行重復實驗，實驗結果好于優(yōu)化前結果。 5．在FPase分離純化的過程中，粗酶液經(jīng)過超濾濃縮后，采用了硫酸銨和CTAB對樣品的聯(lián)合處理方法，再經(jīng)過SepharoseCL-6B制備柱的處理，除去了雜蛋白和大部分的雜多糖。最后經(jīng)分析用Sephacryls-100和DEAE—SephadexG-50得到

7、單一組分，收集組分透析凍干進行電泳分析和酶學性質(zhì)分析，電泳結果為FPase為單一條帶，分子量為55．4KD，酶學的性質(zhì)為FPase最適反應pH值為7．2，在pH值6．8-7．4范圍內(nèi)穩(wěn)定，該酶最適反應溫度為50℃，在30℃-50℃穩(wěn)定，2n2+和Co2+對FPase活力有一定的促進作用，F(xiàn)e3+對它有很強的抑制作用，而Ca2+、Mg2+和Na+對酶活力基本沒有影響。 在實驗過程中考察了FPase對底物專一性的研究，F(xiàn)Pase對C

8、MC也有一定的催化能力，且與濾紙酶活的比值近10：1，這就說明了在濾紙的降解過程中，此酶組分存在著雙功能的作用，一方面對結晶區(qū)纖維素的催化能力并且從纖維素的兩端切下二糖單元，另一方面又能發(fā)揮水解非結晶區(qū)的作用，可以猜測FPase在結構上有著多個功能域（或者說是一個雙功能酶）（endoglucanase和CBH），它們共同協(xié)同從而達到高效降解纖維素的作用。使從濾紙降解的速率方面考慮，此酶具有高效性和多功能性的特點。由此可以推斷，在細菌FP