熱纖梭菌及生孢噬纖維粘菌降解結晶纖維素超分子結構分析.pdf

1、高等植物所產(chǎn)生的纖維素是地球上最豐富的生物聚合物，其干重占整個植物細胞壁的40-60％。隨著化石燃料的日益緊缺，如何將不溶性的纖維素轉(zhuǎn)化成生物燃料成了人們所廣泛關注的熱點。然而，在億萬年的進化過程中，植物進化形成了具有超分子層次特點的細胞壁結構，這種結構以纖維素為核心骨架，外側包被半纖維素和木質(zhì)素，其可以有效抵御來自微生物和動物的侵害，起到了結構屏障的作用，即“生物質(zhì)抗降解屏障(biomassrecalcitrance)”。目前，充分利

2、用纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇等燃料的主要障礙是缺乏低成本的降解轉(zhuǎn)化技術。
　　 纖維素酶對纖維素的降解是一個超分子結構局部的降解過程，有特定的方向，有特定的接觸面，所以是一個非均質(zhì)的過程，因此，就產(chǎn)生了“有限反應面積的問題”。從而，如何高效降解單根微纖絲甚至如何高效降解多根微纖絲就成了人們關注的新的科學問題。本研究主要從底物變化的角度，利用掃描電鏡、原子力顯微鏡以及切片技術、紅外光譜測定、XRD測定等分析熱纖梭菌和生孢噬纖維粘菌降解前

3、后結晶纖維素CF11和WhatmanNo1.濾紙的結構等的變化，原位表征熱纖梭菌和生孢噬纖維粘菌對結晶纖維素的高效降解效率，期待澄清熱纖梭菌等對結晶纖維素的降解機制。本研究主要取得了以下研究成果:
　　 1、以ClostridiumthermocellumLQRⅠ作為菌株的微生物厭氧培養(yǎng)體系的建立。
　　 近年來對于熱纖梭菌降解纖維素的效率的研究大都趨于購買纖維小體純品來對纖維素進行降解，通過對產(chǎn)物進行分析來表征熱纖梭菌

4、菌體對纖維素的降解效率，這具有一定的局限性。為了更有效地動態(tài)觀察熱纖梭菌對纖維素的降解效率，同時表征降解過程中底物的變化和產(chǎn)物的變化是非常有必要的，然而，微生物技術國家重點實驗室均應用好氧微生物體系進行相關的研究，沒有厭氧微生物體系的現(xiàn)成的方法，本文建立了一套本實驗室適用的微生物厭氧培養(yǎng)體系。
　　 2、可用于超微結構分析測定的纖維素樣品處理方法構建。
　　 熱線梭菌在降解結晶纖維的過程中，由于其是通過分泌纖維小體和游離

5、的纖維素酶對纖維素進行降解的，殘余的纖維素表面會留有大量的菌體及蛋白等，這對后續(xù)的XRD測定以及超微結構分析等都會造成干擾。通過利用0.05M焦磷酸鈉4℃過夜反復浸泡，單蒸水100℃煮沸30min的方法，結合紅外測定結果發(fā)現(xiàn)，基本除去了纖維素表面的蛋白等雜質(zhì)，適宜用于后續(xù)的實驗分析。
　　 3、首次實現(xiàn)原子力顯微鏡對纖維素整體超微結構的觀測分析。
　　 本研究主要是利用原子力顯微鏡等觀察熱線梭菌等降解結晶纖維素前后，纖維

6、素超微結構的變化，但是，原子力顯微鏡僅僅只能對纖維素的局部進行掃描，不能很直觀地觀察到整體結構的變化。通過采取對單根纖維細胞切片的連續(xù)掃描，最后利用JPK軟件包將所有掃描的圖片拼接起來的方法獲得單根纖維細胞切片的整體掃描圖，便能直觀地通過整根纖維細胞的變化情況。
　　 4、熱線梭菌降解纖維素過程中纖維素結構觀測及酶動力學性質(zhì)分析。
　　 熱纖梭菌可高效降解結晶纖維素。在48-72h內(nèi)，CF11含量由90％降至60％，PH

7、105的含量由90％降至37％。干燥樣品在1625cm-1處的紅外吸收峰隨降解時間逐漸增強證明在這一過程中纖維表面蛋白含量逐漸增加。XRD測定發(fā)現(xiàn)，降解前后結晶纖維素結晶度穩(wěn)定。以PH105為碳源的發(fā)酵過程中，最終可檢測到的還原糖的質(zhì)量為初始底物濃度的11％;CF11為碳源的發(fā)酵液中，最終可檢測到的還原糖的質(zhì)量為初始底物濃度的5％。培養(yǎng)基的pH值由7.5下降到6.0左右。對以PH105和CF11為碳源培養(yǎng)的熱纖梭菌隔天取樣的發(fā)酵液進行S

8、DS電泳、活性電泳考染、CMC酶活性電泳、木聚糖酶活性電泳，其結果是是相一致的，SDS電泳用肉眼可以明顯分辨的蛋白條帶數(shù)為18條，其中分子量大于116kDa的蛋白條帶數(shù)為4條，主要蛋白分子量集中在45-116kDa之間。同時，通過活性電泳考染、CMC酶活性電泳以及木聚糖酶活性電泳圖譜可以看出，主要酶活性條帶集中在分離膠的上半部甚至濃縮膠點樣孔附近，第4天左右具有活性的蛋白含量達到最大值。
　　 5、熱纖梭菌以及生孢噬纖維粘菌降解

9、的結晶纖維素表面/切片的原子力顯微鏡觀測。
　　 利用原子力顯微鏡對熱纖梭菌降解的結晶纖維素的觀測可以得出，熱纖梭菌通過組裝纖維小體和分泌游離的纖維素酶系統(tǒng)對結晶纖維素進行剝離式降解，纖維表面平坦整齊，通過切片觀測發(fā)現(xiàn)纖維素整體微纖絲的量由表面逐漸向里減少，殘余的微纖絲排列依然緊密。而生孢噬纖維粘菌由于其既不分泌游離的纖維素酶系，又不形成明顯的纖維小體，其對結晶纖維素的降解主要是依靠附著在菌體之上的酶系的作用，從而留下極為明顯的