黃孢原毛平革菌及其關(guān)鍵功能酶對(duì)木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化特性的研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生有機(jī)資源。天然的木質(zhì)纖維素是由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素構(gòu)成；其中木質(zhì)素是高度不規(guī)則且不可溶的聚合物，它通過共價(jià)鍵與半纖維素相連接形成木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物，此后又與纖維素相包裹形成結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的植物細(xì)胞壁，即天然的木質(zhì)纖維素。如此復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)既妨礙了木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化，同時(shí)也導(dǎo)致自然界中木質(zhì)纖維素的降解過程非常緩慢。由于木質(zhì)素對(duì)木質(zhì)纖維素的保護(hù)作用及其自身的難降解特性使得木質(zhì)素降解成為木質(zhì)纖維素降解的

2、關(guān)鍵因素和限速步驟。堆肥化處理技術(shù)是實(shí)現(xiàn)有機(jī)固體廢物無(wú)害化、減量化、資源化的重要手段。但是傳統(tǒng)的堆肥方法存在歷時(shí)長(zhǎng)，肥效低，有機(jī)質(zhì)傳化不完全等問題。特別是富含木質(zhì)纖維素廢物的堆肥基質(zhì)，其影響更加明顯。白腐菌是目前所發(fā)現(xiàn)的一類唯一能徹底降解木質(zhì)素的微生物，它可以分泌木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶等胞外酶降解木質(zhì)素。黃孢原毛平革菌是白腐菌的典型代表，因此，本研究選擇了黃孢原毛平革菌作為研究對(duì)象，系統(tǒng)地考察了該菌體及其關(guān)鍵功能酶在簡(jiǎn)單固

3、態(tài)條件下(固態(tài)發(fā)酵)和復(fù)雜固態(tài)條件下(堆肥體系)中對(duì)天然木質(zhì)素降解能力及降解機(jī)理。
　　 在固態(tài)發(fā)酵條件下，黃孢原毛平革菌接種濃度過高而會(huì)影響木質(zhì)纖維素的降解效率，過低則會(huì)導(dǎo)致其降解效果較差。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，最佳的接種濃度為4mL/35g干樣。在此接種濃度下，木質(zhì)素的降解率可以達(dá)到39.1％。此外由于木質(zhì)素的屏障作用被打破，黃孢原毛平革菌對(duì)半纖維的降解能力也有了顯著的提高。電鏡掃描結(jié)果與紫外光譜分析結(jié)果也表明，在此接種濃度下黃孢

4、原毛平革菌對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)破壞的程度最為嚴(yán)重。
　　 將黃孢原毛平革菌接種子堆肥體系，結(jié)果表明它可以顯著提高木質(zhì)素和半纖維素的降解率，但對(duì)纖維素的降解影響不是很明顯。此外本實(shí)驗(yàn)還考察了該菌對(duì)堆肥過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。因此，在堆肥過程中監(jiān)測(cè)了腐殖質(zhì)、胡敏酸、富里酸以及腐殖化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，接種黃孢原毛平革菌對(duì)富里酸形成的影響不明顯，但它可以顯著增加胡敏酸的含量。腐殖化指標(biāo)結(jié)果表明黃孢原毛平革菌可以有效地促進(jìn)堆肥腐熟速度，

5、縮短堆肥周期，提高堆肥腐殖質(zhì)的穩(wěn)定性以及腐殖化度。腐殖質(zhì)的光學(xué)特性以及其分級(jí)分析結(jié)果表明接種黃孢原毛平革菌可以促進(jìn)堆料中脂肪類、多糖類等物質(zhì)的降解，同時(shí)還可以有效提高芳環(huán)族類化合物的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，隨著堆肥時(shí)間的推進(jìn)，處理樣中胡敏酸芳構(gòu)化的進(jìn)程被加速；最后，聚類結(jié)果表明，接種黃孢原毛平革菌可以有效縮短堆肥周期，促進(jìn)堆體提前腐熟和穩(wěn)定。
　　 黃孢原毛平革菌主要依靠其所分泌的胞外酶降解木質(zhì)素。本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)法考察了愈創(chuàng)木

6、酚與復(fù)合碳源共降解對(duì)黃孢原毛平革菌產(chǎn)酶的影響；同時(shí)探討不同分子結(jié)構(gòu)對(duì)酶催化機(jī)制的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：同時(shí)添加愈創(chuàng)木酚及不同結(jié)構(gòu)的碳源對(duì)該菌產(chǎn)酶有顯著影響，高濃度的愈創(chuàng)木酚對(duì)產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用；在培養(yǎng)基中添加愈創(chuàng)木酚2mmol/L、葡萄糖2.5g/L和糊精5g/L，可以顯著提高黃孢原毛平革菌的綜合產(chǎn)酶能力；黃孢原毛平革菌可以分泌纖維素酶和木聚糖酶，而且二者之間有較好的線性正相關(guān)關(guān)系。
　　 將以上優(yōu)化條件得到的高活性粗酶液添加至

7、富含木質(zhì)纖維素的堆肥體系中，考察其對(duì)堆肥基質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明：添加酶液主要是有利于打破木質(zhì)素所形成的屏障作用，同時(shí)使半纖維素得以暴露，因此半纖維素的降解率也可以被有效提高，此結(jié)果與直接接種黃孢原毛平革菌菌體的效果相類似。腐殖質(zhì)變化結(jié)果表明，酶液對(duì)胡敏酸形成的影響主要作用于堆肥后期(30d以后)，但此階段以促進(jìn)微生物對(duì)腐殖質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換為主，而對(duì)于有機(jī)物降解能力的影響不明顯。堆肥過程的酶活性變化表明，堆肥過程中LiP和MnP的

8、活性高峰是交替出現(xiàn)，且添加酶液對(duì)LiP的影響主要體現(xiàn)在堆肥后期。FTIR光譜分析結(jié)果表明，添加酶液有利于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中甲基、亞甲基以及羥基基團(tuán)的降解，同時(shí)GC/MS結(jié)果分析表明，添加酶液可以促進(jìn)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中苯環(huán)氧化開環(huán)，C-C鍵的斷裂以及雙鍵氧化等。這些作用均有利于堆肥過程中其它微生物群落的營(yíng)養(yǎng)供給以及物質(zhì)進(jìn)一步的降解與轉(zhuǎn)化。
　　 為了進(jìn)一步從機(jī)理上了解添加關(guān)鍵功能酶對(duì)堆肥過程的影響，本章節(jié)以Biolog方法為主要監(jiān)測(cè)手段，結(jié)合

9、聚類分析以及PCA分析方法，考察添加酶液對(duì)富含木質(zhì)纖維素堆體中微生物群落代謝能力的影響。結(jié)果表明，添加酶液可以顯著提高微生物對(duì)有機(jī)碳的降解能力；AWCD的變化表明，當(dāng)堆肥進(jìn)入第6d后，添加酶液后，微生物對(duì)胺類碳源的代謝能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)在堆肥進(jìn)入第15d后，微生物對(duì)羧酸類碳源和聚合物類碳源的能力也有較為明顯的提高。微生物群落代謝聚類分析結(jié)果表明，添加酶液可以改善堆肥微生物對(duì)中間代謝產(chǎn)物類碳源的代謝能力。通過主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，添加