黃孢原毛平革菌木質(zhì)素降解酶系的生產(chǎn)、純化及在合成手性亞砜中的應(yīng)用.pdf

1、黃孢原毛平革菌在發(fā)酵條件下可以同時生產(chǎn)乙二醛氧化酶、木素過氧化物酶和錳過氧化物酶等木質(zhì)素降解酶系，但在不同的條件如限氮、限碳、空氣或高氧環(huán)境下三種酶的生產(chǎn)能力有所不同。本文將在搖瓶中重點研究限碳培養(yǎng)黃孢原毛平革菌生產(chǎn)乙二醛氧化酶，對其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。在鼓泡塔中研究生產(chǎn)乙二醛氧化酶、木素過氧化物酶和錳過氧化物酶等三種木質(zhì)素降解酶系。酶系經(jīng)過適當(dāng)?shù)募兓?，再進(jìn)行固定化和催化苯甲硫醚生成手性苯甲亞砜的應(yīng)用研究。
　　 在搖瓶中，

2、黃孢原毛平革菌限氮和限碳培養(yǎng)都能合成乙二醛氧化酶，限碳培養(yǎng)時利用聚氨酯泡沫固定化菌體能更有效地合成乙二醛氧化酶。乙二醛氧化酶的底物，如丙酮醛、乙二醛等，不能誘導(dǎo)乙二醛氧化酶的合成，而黎蘆醇、苯甲醇能較好的誘導(dǎo)乙二醛氧化酶的合成。Fe2+、Cu2+對乙二醛氧化酶的合成影響不大；Mn2+對乙二醛氧化酶影響較大，濃度在2.96×10-5mol/L時酶活力較高?？諝猸h(huán)境中能合成乙二醛氧化酶，但效果不如通氧。經(jīng)過優(yōu)化后搖瓶限碳培養(yǎng)能獲得乙二醛氧化

3、酶活力為29.1U/L。
　　 在鼓泡塔限碳培養(yǎng)黃孢原毛平革菌時，其乙二醛氧化酶產(chǎn)酶周期與搖瓶培養(yǎng)相同，在第5天活力最高，達(dá)到20.1U/L。在通氣量試驗時，通1.0vvm的空氣比較適合產(chǎn)酶。通入氣體為含氧空氣時，發(fā)現(xiàn)通入含氧50％～80％的空氣能提高產(chǎn)量20％左右；利用相同的固定化菌體進(jìn)行重復(fù)分批培養(yǎng)時，重復(fù)培養(yǎng)3批后活力還能維持在10U/L以上。用鼓泡塔限氮培養(yǎng)固定化黃孢原毛平革菌時，通入80％氧氣含量的空氣，通氣量維持在0

4、.75vvm，木素過氧化物酶和錳過氧化物酶在第5天達(dá)最高活力，分別為311.8U/L和68.2U/L，乙二醛氧化酶的活力較低，為10.1U/L。
　　 限碳發(fā)酵液經(jīng)過濃縮、鹽析、透析等純化步驟，能得到活力為233.6U/L、比活力為283.7U/g的乙二醛氧化酶酶液，分別比純化前提高9.6倍和1.8倍。限氮發(fā)酵液經(jīng)過鹽析、透析、DEAE-Sepharose離子交換等步驟，能得到活力分別為1137.5U/L、241.0U/L的木素

5、過氧化物酶和錳過氧化物酶的酶液，分別提高3.8倍和3.0倍。酶液經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定得出，木素過氧化物酶LiP分子量約為42 kDa，錳過氧化物酶MnP分子量約為47 kDa，與相關(guān)文獻(xiàn)報道相似。
　　 以聚氨酯泡沫為載體的共價結(jié)合法能有效地固定木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和乙二醛氧化酶，得到的固定化酶的活力分別為0.11U/g、0.036U/g和0.015U/g，酶活力回收分別為25.6％、39.1％和21.4％。使用混