老年大鼠GnRH1表觀變化及瓊玉膏延緩衰老的分子機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　通過對老年大鼠與青年大鼠下丘腦衰老相關(guān)基因GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)水平以及GnRH1基因甲基化情況進(jìn)行分析，從表觀遺傳水平探討大鼠自然衰老進(jìn)程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及GnRH1基因甲基化的改變;通過分離新生大鼠下丘腦神經(jīng)元干細(xì)胞，建立D-半乳糖誘導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元干細(xì)胞衰老模型，比較正常神經(jīng)元干細(xì)胞組、D-半乳糖誘導(dǎo)衰老組與不同濃度瓊玉膏干預(yù)組之間細(xì)胞成球能力、炎性因子及NF-κ

2、B表達(dá)的差異，為揭示瓊玉膏延緩神經(jīng)元干細(xì)胞衰老的功效及其可能分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)參考和數(shù)據(jù)支持。
　　方法:
　　觀察比較6只24月齡自然衰老SD大鼠和6只2月齡青年SD大鼠下丘腦衰老相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平:Real-Time PCR檢測GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a基因mRNA表達(dá)水平;Western Blot檢測GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a蛋白表達(dá)水平;使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟

3、件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MSP法檢測老年大鼠和青年大鼠GnRH1基因甲基化情況。
　　分離培養(yǎng)8只新生SD大鼠（出生24h內(nèi)）下丘腦神經(jīng)元干細(xì)胞，免疫熒光法檢測神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)，鑒定神經(jīng)元干細(xì)胞;CCK8法檢測瓊玉膏對神經(jīng)元干細(xì)胞增殖的影響（OD值），使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50，為后續(xù)分組實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。取神經(jīng)元干細(xì)胞分成A、B、C、D四組，采用NSCs完全培養(yǎng)基分別對四組進(jìn)行原代培養(yǎng)至第8天;從第9天起，A組繼續(xù)采用

4、培養(yǎng)基培養(yǎng)24h;B組依據(jù)參考文獻(xiàn)加入10mg/mLD-半乳糖致衰24h;C組先加90μg/mL(1/2 IC50)瓊玉膏干預(yù)6h，再加10mg/mL D-半乳糖致衰24h;D組先加45μg/mL(1/4 IC50)瓊玉膏干預(yù)6h，再加10mg/mL D-半乳糖致衰24h。倒置熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元干細(xì)胞形態(tài)及成球能力(SFE);Real-Time PCR檢測各組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)mRNA表

5、達(dá)水平;Western Blot檢測核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-κB)蛋白表達(dá)水平;Elisa檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)蛋白表達(dá)水平;使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.GnRH1、Sirt1、DNMT1基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在老年鼠中明顯降低，與青年鼠比較有顯著性差異(p＜0.05); DNMT3a基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在老年鼠和青年鼠之間無顯著

6、性差異(p＞0.05);老年鼠GnRH1基因出現(xiàn)部分甲基化，青年鼠GnRH1基因未出現(xiàn)甲基化。
　　2.從新生鼠下丘腦成功分離神經(jīng)元干細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成球狀生長;免疫熒光法檢測到細(xì)胞球體有NSE清晰的紅色熒光信號，即NSE在神經(jīng)元干細(xì)胞中陽性表達(dá)。
　　3.CCK8法檢測到瓊玉膏對神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖作用（OD值）與時間和劑量存在一定的依賴關(guān)系，24h內(nèi)瓊玉膏濃度變化對細(xì)胞的影響較小;根據(jù)24h對應(yīng)的IC50值(18

7、5.91μg/mL)，選取1/2 IC50(90μg/mL)和1/4 IC50(45μg/mL)作為后續(xù)分組實(shí)驗(yàn)時瓊玉膏的濃度值。
　　4.成功建立D-半乳糖誘導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元干細(xì)胞衰老模型，呈現(xiàn)典型的炎癥樣變化:細(xì)胞成球能力降低，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-κB)信號通路被激活，cytoplasmP65表達(dá)水平下降，nuclear P

8、65表達(dá)水平上升。
　　5.90μg/mL(1/2 IC50)瓊玉膏干預(yù)組與D-半乳糖衰老模型組比較細(xì)胞成球能力顯著恢復(fù)(p＜0.05)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(p＜0.05)，核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-κ B)轉(zhuǎn)錄活性被抑制，cytoplasm P65表達(dá)水平上升，nuclear P65表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論:
　　1.GnRH1、Sirt1

9、基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在老年鼠和青年鼠之間有顯著性差異，說明GnRH1、Sirt1的表達(dá)水平與增齡呈負(fù)相關(guān)。
　　2.DNMT1基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在老年鼠中顯著降低，DNMT3a基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在老年鼠和青年鼠之間無顯著性差異，說明DNMT1的表達(dá)水平與增齡呈負(fù)相關(guān)，DNMT3a的表達(dá)水平不隨增齡而變化。
　　3.GnRH1基因在老年鼠中出現(xiàn)部分甲基化，在青年鼠中未出現(xiàn)甲基化，說明GnRH1基因的表達(dá)水

10、平受到其啟動子區(qū)甲基化的調(diào)控，大鼠機(jī)體發(fā)生自然衰老與GnRH1基因啟動子甲基化從而抑制GnRH1的表達(dá)水平有關(guān)。
　　4.瓊玉膏能預(yù)防D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元干細(xì)胞衰老模型的炎癥反應(yīng):恢復(fù)細(xì)胞成球能力、抑制炎性指標(biāo)，且其作用強(qiáng)度呈濃度依賴性，隨著瓊玉膏濃度從45μg/mL增加到90μg/mL，其延緩衰老作用也相應(yīng)增強(qiáng)。
　　5.由于NF-κB具有負(fù)調(diào)控GnRH1基因mRNA表達(dá)的功能，因此瓊玉膏延緩衰老作用的可能分子機(jī)制在于抑