PI3K-AKT-GSK-3β通路在萊菔硫烷調(diào)控糖尿病大鼠認(rèn)知功能減退中的作用.pdf

1、流行病學(xué)資料顯示，我國已成為糖尿病（Diabetes mellitus，DM）大國，患者數(shù)量呈上升趨勢。糖尿病是臨床上常見的代謝性疾病之一，以慢性持續(xù)性高血糖為特征，長期的不當(dāng)治療甚至不治療，可誘導(dǎo)多個系統(tǒng)出現(xiàn)并發(fā)癥，包括糖尿病腎病、血管病變以及神經(jīng)系統(tǒng)病變。認(rèn)知功能障礙是糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)常見并發(fā)癥,其臨床特征為緩慢的認(rèn)知功能減退，包括學(xué)習(xí)、記憶、定向、思維、理解能力的減退和人格改變，無意識障礙。目前，糖尿病性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚不明

2、了。普遍認(rèn)為，炎癥、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等因素參與糖尿病認(rèn)知障礙的發(fā)生、發(fā)展，特別是凋亡途徑。PI3K/AKT/GSK-3β通路可調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞增殖、存活、代謝及凋亡。內(nèi)源性或外源性刺激可抑制該通路，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放,導(dǎo)致細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cytc）釋放至胞漿，激發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，啟動線粒體凋亡程序。萊

3、菔硫烷(Sulforaphane，SFN)廣泛存在于花椰菜，西蘭花，羽衣甘藍(lán)等十字花科植物中。目前，SFN被廣泛應(yīng)用于防癌和抗癌[1]，通過調(diào)節(jié)易感性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、血管生成以及侵襲轉(zhuǎn)移等腫瘤相關(guān)事件來發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，SFN還具有多種藥理作用包括降低血糖、調(diào)節(jié)脂代謝以及改善心、腦、腎和肌肉損傷。
　　本研究采用SD大鼠作為實驗動物，腹腔注射STZ構(gòu)建糖尿病大鼠模型，行為學(xué)及形態(tài)學(xué)觀察糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元

4、形態(tài)。SFN對糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠進(jìn)行干預(yù)，檢測PI3K/AKT/GSK-3β信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化情況以及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白（caspase-3、caspase-9）和Cytc的表達(dá)水平，探討SFN改善糖尿病認(rèn)知功能減退的機(jī)制。
　　第一部分：糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠模型建立及萊菔硫烷的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：
　　構(gòu)建糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠模型，觀察SFN對糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠行為學(xué)及形態(tài)學(xué)的影響，明確SF

5、N的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：
　　采用隨機(jī)數(shù)字表將120只大鼠隨機(jī)分為正常對照組（CON組）（n=53）和糖尿病模型組（DM組）（n=67）。根據(jù)糖尿病大鼠造模方法，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，腹腔注射 STZ（注射前禁食12h），劑量為60mg/kg。注射方法：避光環(huán)境下配置STZ溶液，全程在冰上操作，STZ溶液濃度為2.5％，腹腔注射。CON組大鼠同一位置注射等體積二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO

6、)。3天后，檢測大鼠隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L，視為糖尿病大鼠造模成功。造模前和造模后第2、4、6、7、8、9、10周末測量大鼠血糖及體重，并于各時間點選取5只大鼠，進(jìn)行Y迷宮及HE染色實驗。驗證糖尿病大鼠是否發(fā)生認(rèn)知功能減退。將糖尿病認(rèn)知功能大鼠隨機(jī)分為糖尿病認(rèn)知功能減退組（DACD組）（n=8）、萊菔硫烷組（SFN組）（n=24）。將SFN組分為10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg三個劑量梯度，分別為SFNL組、SFN

7、M組和SFNH組，每組8只大鼠。CON組8只大鼠。觀察大鼠用藥前后的血糖及體重變化，Morris水迷宮檢測大鼠干預(yù)前后的逃避潛伏期及在目標(biāo)象限停留時間變化，HE檢測大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化，明確SFN的神經(jīng)保護(hù)作用。應(yīng)用Image Lab5.1分析系統(tǒng)對實驗結(jié)果進(jìn)行測定分析。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05則差異具有統(tǒng)計意義。
　　結(jié)果：
　　1.STZ注射后72小時，檢

8、測實驗動物隨機(jī)血糖值≥16.7mmol/L，糖尿病模型成功建立。造模前和造模后第2、4、6、7、8、9、10周末，檢測大鼠體重和血糖，DM大鼠體重均低于相同時間點的CON組，血糖值均明顯高于CON組（P＜0.05）；
　　2.Y迷宮檢測結(jié)果，DM大鼠發(fā)病后第4和第6周末認(rèn)知水平無明顯降低；DM大鼠發(fā)病后第8周末，大鼠出現(xiàn)輕微認(rèn)知變化，但與CON比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；DM大鼠發(fā)病后第9~10周末出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退，即視

9、為糖尿病認(rèn)知功能減退模型成功建立，與CON組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；
　　3.HE染色結(jié)果表明，CON組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、緊密，胞漿及細(xì)胞核飽滿、清晰可見。DM大鼠發(fā)病后第8周末，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬CA1區(qū)少量細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化；而在發(fā)病后第9~10周末，大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂、松散，細(xì)胞變小，出現(xiàn)核固縮，染色質(zhì)聚集，且胞漿減少。
　　4.SFN對DACD大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠血糖較DACD組有所降

10、低，體重有所增長，其中以SFNM組和SFNH組最為明顯，但均未達(dá)到CON組水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SFNM組和SFNH組血糖及體重與DACD組比較具有顯著差異（P＜0.05）。提示SFN具調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖和體重的功效，SFN的調(diào)節(jié)代謝的作用隨濃度的增加而增加，但當(dāng)濃度為25mg/kg時，進(jìn)一步增加劑量，SFN的降糖作用不再增加；
　　5.SFN干預(yù)后，進(jìn)行Morris水迷宮檢測SFN對糖尿病大鼠行為學(xué)影響，逃避

11、潛伏期統(tǒng)計結(jié)果顯示，大鼠逃避潛伏期短于與 DACD組（P＜0.05），其中以SFNM組和SFNH組最為明顯（P＜0.05），但仍長于CON組，SFNM組和SFNH組大鼠逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；撤掉平臺后，DACD組大鼠在平臺象限停留的時間短于CON組大鼠（P＜0.05），SFN組大鼠在目標(biāo)象限停留時間長于DACD組，其中以 SFNM組和SFNH組大鼠最為顯著，但仍短于CON組（P＜0.05），SFNM組和SFNH組之間比

12、較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；
　　6.SFN干預(yù)后，HE染色發(fā)現(xiàn)，SFN組的大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)目較DACD組增多，SFNM組和SFNH組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)目最多，SFNM組和SFNH組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示SFN的最適劑量為25mg/kg，再增加SFN的劑量，其腦保護(hù)作用不再增加。
　　第二部分：萊菔硫烷通過PI3K/AKT/GSK3β信號通路對糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

13、
　　目的：
　　研究SFN干預(yù)后信號通路PI3K/AKT/GSK3β的調(diào)節(jié)變化，確定SFN對糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用是否通過激活PI3K/AKT/GSK3β來實現(xiàn)。
　　方法：
　　將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：CON組、DACD組、SFN組、SFN+SY294002（PI3K/AKT抑制劑）組及 SFN+Lcil（GSK-3β特異性抑制劑）組，每組10只。Westernblot檢測AKT、GSK3

14、β磷酸化水平以及MCL-1蛋白表達(dá)情況，TUNEL檢測海馬神經(jīng)元凋亡狀況。實驗結(jié)果的測定記錄及統(tǒng)計分析同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.Western blot檢測AKT、p-AKT結(jié)果顯示，與CON組比較，DACD組P-AKT表達(dá)水平顯著降低，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；與DACD組相比，SFN組P-AKT蛋白水平明顯升高，而抑制劑LY294002抵消了SFN的這一作用。Licl干預(yù)后, p-AKT表達(dá)水平與D

15、ACD組和SFN比較顯著增高（P＜0.05）；
　　2.Western blot檢測磷酸化GSK-3β（ser9）結(jié)果顯示，與CON組比較，DACD組 p-GSK-3β（ser9）的表達(dá)水平顯著降低，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；與DACD組相比，SFN組p-GSK-3β（ser9）蛋白水平明顯升高，而抑制劑 LY294002抵消了 SFN的這一作用。SFN+Licl組p-GSK-3β（ser9）表達(dá)水平高于SFN組（P

16、＜0.05）；
　　3.Western blot檢測MCL-1結(jié)果顯示，與CON組比較，DACD組MCL-1表達(dá)水平顯著降低，兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；SFN使DACD組MCL-1蛋白水平明顯升高，抑制劑LY294002抵消了SFN的干預(yù)作用。Licl（GSK-3β特異性抑制劑）干預(yù)后, MCL-1表達(dá)水平高于DACD組和SFN組（P＜0.05）；
　　4.TUNEL結(jié)果顯示，CON組偶見凋亡神經(jīng)細(xì)胞，DACD

17、組和SFN+LY294002組凋亡神經(jīng)元數(shù)目最多，與CON相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與DACD組相比，SFN組和SFN+Licl組神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第三部分：萊菔硫烷通過PI3K/AKT/GSK-3β抑制線粒體凋亡途徑
　　目的：
　　探討糖尿病認(rèn)知功能減退大鼠海馬神經(jīng)元 MPTP開放以及caspase-9和 caspase-3表達(dá)水平變化，明確 SFN是否

18、通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路調(diào)節(jié)線粒體凋亡，改善糖尿病大鼠腦損傷。
　　方法：
　　75只雌性SD大鼠被隨機(jī)分為五組：CON組、DACD組、SFN組、SFN+SY294002組及 SFN+Lcil組，每組15只。Westernblot檢測caspase-9、caspase-3以及Cyt c蛋白表達(dá)情況，分光光度計法檢測大鼠海馬神經(jīng)元 MPTP開放程度，透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果的測定記錄及

19、統(tǒng)計分析同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.吸光度值檢測結(jié)果，DACD組線粒體（maxA520-minA520）顯著高于CON組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（DACD vs CON=0.096±0.018 vs0.021±0.004，P＜0.05）;與DACD組比較，SFN緩解了（maxA520-minA520）升高（SFN vs DACD=0.059±0.020 vs0.096±0.018， P＜0.05；給予LY294002，抵消

20、了SFN的干預(yù)作用;GSK-3β抑制劑Licl疊加了SFN的干預(yù)作用；
　　2.Western blot檢測caspase-9結(jié)果顯示，CON組caspase-9蛋白僅有少量表達(dá)。與CON組相比，DACD組caspase-9表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與DACD組相比，SFN組caspase-9表達(dá)顯著降低（P＜0.05），LY294002和SFN雙干預(yù)抵消了SFN降低caspase-9的效應(yīng)（P＜0.05）。SFN+Licl（

21、GSK-3β特異性抑制劑）組與DACD組和SFN組比較，caspase-9表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；
　　3.Western blot檢測caspase-3結(jié)果顯示，CON組caspase-3蛋白僅有少量表達(dá)。與CON組相比，DACD組caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與DACD組相比，SFN組caspase-9表達(dá)顯著降低（P＜0.05），LY294002抵消了SFN降低caspase-3的效應(yīng)（P＜0.0

22、5）。SFN+Licl（GSK-3β特異性抑制劑）組與DACD組和SFN組比較，caspase-3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；
　　4.Western blot檢測Cyt c結(jié)果顯示，CON組Cyt c蛋白僅有少量表達(dá)。與CON相比，DACD組Cyt c表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與DACD組相比，萊菔硫烷使Cyt c表達(dá)顯著降低（P＜0.05），LY294002抵消了萊菔硫烷降低Cyt c的作用（P＜0.05）。Licl

23、（GSK-3β特異性抑制劑）組與DACD組和SFN組比較，caspase-3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；
　　5.大鼠腦組織電鏡結(jié)果，CON組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞器排列緊密，形態(tài)完整，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見。DACD組神經(jīng)元染色質(zhì)大量邊集，線粒體腫脹、脊消失，包漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多空泡。上述超微結(jié)構(gòu)損傷，在SFN干預(yù)后明顯減輕，但LY294002抵消了萊菔硫烷的作用。Licl（GSK-3β特異性抑制劑）疊加SFN的作用。
　　結(jié)