芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機理及代謝組學研究.pdf

1、慢性心力衰竭作為嚴重威脅人類健康的慢性、難治性疾病之一，是多因素相互作用的復雜病理過程，傳統(tǒng)中醫(yī)藥對其臨床指導價值日益凸顯。中醫(yī)脈絡學說指出氣陽虛乏是其基本病機，陽氣失于溫煦，運血無力，營衛(wèi)失和、氣化失司，津血互換障礙，導致痰瘀阻絡，津液不能回流聚于絡外，而發(fā)為“氣分”、“血分”、“水分”病變，據此確立“氣血水同治分消”治則和“益氣溫陽、活血通絡、利水消腫”治法，制定芪藶強心膠囊組方。本研究選用芪藶強心膠囊作為干預藥物，揭示其對慢性心力

2、衰竭大鼠心功能、RAAS系統(tǒng)、心肌微血管、腎臟水代謝等干預作用及其相關機制，同時采用代謝組學技術和生物信息學分析方法，揭示血漿內源性代謝物和藥效作用之間的相關性研究，為復方中藥現代化研究提供方法學探索，為佐證脈絡學說科學價值提供研究數據支撐。
　　第一部分：芪藶強心膠囊對心梗后心力衰竭大鼠心功能及作用機制研究
　　目的：探討芪藶強心膠囊對慢性心力衰竭大鼠心功能、心臟微血管，以及腎臟水代謝的影響。
　　方法：采用結扎冠狀

3、動脈左前降支的方法建立急性心肌梗死（AMI）后心力衰竭大鼠模型，分別以結扎前后心電圖 ST段下降值評價 AMI模型是否成功，4w后小動物超聲儀檢測左室射血分數小于45％判定心力衰竭模型成功，隨機分組并灌胃4w、6w、8w三個時間點后檢測心功能、NT-proBNP水平、RAAS系統(tǒng)的變化，干預8w后觀察心肌組織超微結構、心肌纖維化情況；通過觀察不同時間點血漿神經調節(jié)蛋白1(NRG1)、血管生成素樣蛋白4（AngPTL4）水平，以及干預8w

4、后心肌微血管內皮細胞超微結構、心肌組織 NRG1、AngPTL4蛋白/基因表達情況，揭示通絡復方芪藶強心膠囊對心臟微血管，以及對血管舒張的作用；通過檢測不同時間點降鈣素基因相關肽（CGRP）水平，以及8w后eNOS/鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）/環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）/蛋白激酶G（PKG）蛋白/基因表達情況，進一步驗證芪藶強心膠囊舒張血管是否與 NO介導的cGMP-蛋白激酶系統(tǒng)途徑有關；通過檢測血漿精氨酸加壓素（AVP）水平，以及腎臟受體 V

5、2R及水通道蛋白（AQP2）蛋白/基因表達情況，觀察芪藶強心膠囊對腎臟水代謝的影響。
　　結果：
　　1.證實芪藶強心膠囊能夠抑制慢性心力衰竭大鼠心室重構及 RAAS系統(tǒng)激活，減輕心肌細胞損傷，提高心功能，延緩心衰病程，改善預后
　　超聲心動圖結果顯示，芪藶強心膠囊明顯縮小心力衰竭大鼠心室腔，改善室壁運動協(xié)調性，增加心室收縮、舒張幅度，增加血流量，有效降低左室收縮、舒張末期直徑和容積，提高左室射血分數。提示芪藶強心膠囊

6、能夠改善心力衰竭大鼠心功能，且隨著時間延長，效果顯著。
　　透射電鏡結果顯示，芪藶強心膠囊顯著減少心力衰竭大鼠心肌組織病理損傷，抑制心肌細胞肥大和炎性細胞浸潤，保護心肌細胞超微結構，同時抑制膠原纖維增生，提示芪藶強心膠囊能夠保護心肌細胞結構，抑制慢性心力衰竭心室重構。
　　血漿NT-proBNP水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠血漿NT-proBNP水平各時間點均顯著增高（P<0.01）；與Model組比較

7、， QLQX組時間依賴性的降低血漿NT-proBNP水平（P<0.05, P<0.01）。
　　血漿RAAS系統(tǒng)水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠血漿 RI、AngⅡ、ALD水平各時間點均顯著增高（P<0.01），且隨著時間的延長血漿RI、AngⅡ、ALD升高顯著；與Model組比較，QLQX組不同程度的降低血漿RI、AngⅡ、ALD水平（P<0.05, P<0.01）。
　　2.揭示芪藶強心膠囊能夠保護心

8、臟微血管，舒張血管機制可能與eNOS/sGC/cGMP/PKG通路有關
　　透射電鏡結果顯示，Model組大鼠心臟微血管內皮細胞損傷嚴重，基底膜和連接蛋白受損，微血管官腔狹窄或畸形。芪藶強心膠囊能夠顯著保護連接蛋白，改善微血管內皮細胞超微結構。
　　血漿和心肌組織NRG1、AngPTL4水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠血漿NRG1、AngPTL4水平均明顯降低，心肌組織NRG1、AngPTL4蛋白和基因表

9、達顯著下降（P<0.05, P<0.01），隨著時間的延長血漿NRG1、AngPTL4水平不斷降低；與Model組比較，QLQX組不同程度的升高血漿NRG1、AngPTL4水平，升高心肌組織NRG1、AngPTL4蛋白和基因水平（P<0.05, P<0.01），且隨著時間的延長血漿 NRG1、AngPTL4水平升高顯著。
　　降鈣素基因相關肽（CGRP）水平檢測結果顯示，與Sham組比較， Model組大鼠血漿和主動脈CGRP水平

10、均明顯降低（P<0.01）；與Model組比較，QLQX組升高血漿和主動脈CGRP水平（P<0.05, P<0.01）。
　　eNOS/sGC/cGMP/PKG通路檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠主動脈CGRP、eNOS蛋白表達，以及sGC、PKG mRNA表達均明顯降低（P<0.01）；與Model組比較，QLQX組CGRP、eNOS蛋白水平，以及sGC、PKG mRNA水平明顯增加（P<0.05, P<0.01

11、）。
　　3.揭示通絡復方芪藶強心膠囊通過降低血漿精氨酸血管加壓素（AVP），及其受體V2R、AQP2水平，改善腎臟水代謝
　　血漿AVP水平及其與RAAS系統(tǒng)相關性分析結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠血漿 AVP水平各時間點均顯著增高（P<0.01），且隨著時間的延長血漿AVP始終保持高水平；與Model組比較，QLQX組不同程度的降低血漿AVP水平（P<0.05, P<0.01）。相關性分析顯示，血漿AVP與

12、AngII水平呈顯著正相關（P<0.001）。
　　腎臟V2R及AQP2表達水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組大鼠顯著上調 V2R、AQP2蛋白和 mRNA表達（P<0.01）；與 Model組比較，QLQX組不同程度的降低V2R、AQP2蛋白和mRNA水平（P<0.05, P<0.01）。
　　小結：
　　慢性心力衰竭發(fā)展過程中心臟微血管內皮細胞和心肌細胞受到損傷， RAAS系統(tǒng)激活，血管阻力增大，血流

13、灌注量不足，心室重構，心室壁協(xié)調性較差，腎臟水代謝障礙，心功能下降，同時NT-proBNP水平不斷增高，預后較差。代表性通絡藥物芪藶強心膠囊顯著保護心臟微血管內皮細胞和心肌細胞結構，改善病理損傷，抑制 RAAS系統(tǒng)激活和心室重構，舒張血管，改善腎臟水液代謝，提高心功能，有效延緩心力衰竭病程，改善預后，進一步佐證脈絡學說對慢性心衰防治的指導價值。
　　第二部分：心梗后心力衰竭大鼠血漿代謝組學研究及芪藶強心膠囊干預作用
　　目的

14、：揭示芪藶強心膠囊不同活性成分給予慢性心衰大鼠后血漿內源性代謝物的變化，同時結合生物信息學方法分析藥效作用和代謝物之間的差異性，為揭示芪藶強心膠囊不同生物活性物質在慢性心力衰竭發(fā)展中的治療作用提示數據支持。
　　方法：利用大孔吸附樹脂柱色譜分離方法，分別以不同乙醇濃度（0%、30%、50%、70%、90%）洗脫芪藶強心（QLQX），收集洗脫液得到QLQX-H、QLQX-30%、QLQX-50%、QLQX-70%、QLQX-90%藥

15、粉，分別給予AMI后心衰大鼠，利用GC-MS、Oxylipins、Oxidative and Nitrosative Stress三個代謝組平臺技術分析大鼠血漿內源性代謝物特征；利用芪藶強心膠囊不同乙醇濃度提取物大鼠血漿代謝物差異性，采用主成分分析、偏最小二乘法等生物信息學方法分析上述代謝物與保護心臟微血管、血管舒張和利尿，抑制RAAS系統(tǒng)激活等作用之間的相關性。
　　結果：
　　1.揭示慢性心力衰竭疾病潛在的生物標記物

16、r>　　利用GC-MS、Oxylipins、Oxidative and Nitrosative Stress三個代謝組平臺分析Sham組與Model組大鼠血漿代謝物特征，結果顯示，與Sham組比較，Model組具有高水平疾病標記物且差異顯著（P<0.05）。其中慢性心力衰竭大鼠上調的血漿代謝物溶血磷脂酸（LPA C14:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:1、C20:3、C20:5、C22:5、C22:6）、環(huán)狀溶血磷脂酸（

17、cLPA C16:0, C18:0）、脂質（5,6-DiHETrE、12,13-DiHODE、12,13-DiHOME、9-HOTrE、13-KODE、9-KODE）、有機酸（甘油酸和丙酮酸）；下調的代謝產物分別是脂質（11,12-EpETrE、14,15-EpETrE、8,9-EpETrE、8-iso-PGA1、12S-HEPE、20-HETE、13,14-dihydro-PGF2a、PGE2）；有機酸（2-羥基丁酸，3-羥基丁酸，3

18、-羥基異丁酸，3-羥基異戊酸，乙醇酸，甲基丙二酸，焦谷氨酸），上述代謝物可作為慢性心力衰竭潛在疾病標記物。
　　2.揭示芪藶強心膠囊干預慢性心力衰竭潛在的生物標記物
　　結果顯示：與Model組比較，T3時間點QLQX治療組大鼠血漿有機酸代謝物差異顯著。干預8w后，化合物2-hydroxybutyric acid（2-羥基丁酸），Methylmalonic acid（甲基丙二酸），3-Hydroxybutyric acid（

19、3-羥基丁酸）水平差異顯著，提示上述有機酸代謝產物可作為芪藶強心膠囊干預慢性心力衰竭大鼠潛在的生物標記物。
　　3.揭示芪藶強心膠囊藥效作用和潛在生物標記物之間的相關性
　　三個代謝組平臺共檢測出67種生物標記物，與精氨酸加壓素（AVP）、RAAS系統(tǒng)激活呈負相關，與降鈣素基因相關肽（CGRP）、血管生成素樣蛋白4（AngPTL4）、神經源性蛋白1（NRG1）呈正相關，提示這些代謝產物與抑制 RAAS系統(tǒng)激活、利尿、擴張血管

20、、保護心肌微血管有關。揭示上述潛在的生物活性化合物與脂質、溶血磷脂酸紊亂有關，調節(jié)脂質類物質代謝紊亂可能是芪藶強心膠囊發(fā)揮延緩慢性心衰發(fā)展治療作用的重要途徑。
　　小結：
　　慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中氨基酸、脂質能量等代謝紊亂，其中以脂質代謝紊亂最為嚴重；2-羥基丁酸、甲基丙二酸、3-羥基丁酸等有機酸可作為芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭潛在的生物標記物；芪藶強心膠囊發(fā)揮保護心肌微血管、抑制 RAAS系統(tǒng)激活、利尿、舒張血管的

21、作用與脂質、溶血磷脂酸代謝顯著相關，提示抑制脂類物質紊亂可能是芪藶強心膠囊發(fā)揮延緩慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要途徑。
　　第三部分：芪藶強心膠囊對心梗后心力衰竭大鼠脂質代謝的影響及相關作用機制研究
　　目的：揭示芪藶強心膠囊對慢性心力衰竭脂質過氧化/硝化應激、脂肪酸能量代謝、膽固醇代謝，以及脂質重要轉化途徑的干預作用及其相關機制。
　　方法：采用通過ELISA、分子生物學方法測定血漿8-異前列腺素F2α（8-iso-PG

22、F2α）、3-硝基酪氨酸（3-NT）水平和心肌組織中3-NT蛋白水平，揭示慢性心力衰竭大鼠心肌組織脂質氧化/硝化應激水平及芪藶強心膠囊的干預作用；采用氣相色譜法檢測心肌組織中脂肪酸構成，以了解心肌組織中n-3系和n-6系PUFAs水平及其與血漿游離脂肪酸（FFA）的相關性；圍繞膽固醇、脂肪酸等脂質代謝的關鍵轉錄因子、脂肪酸能量代謝的關鍵激動/限制酶類，以及脂質轉化LOX、COX兩大途徑，通過檢測心肌組織中蛋白/基因表達水平，揭示慢性心力

23、衰竭大鼠上述的代謝過程及芪藶強心膠囊的干預作用機制。
　　結果：
　　1.揭示芪藶強心膠囊能夠抑制脂質過氧化/硝化應激水平
　　與Sham組比較，Model組大鼠血漿8-iso-PGF2α、3-NT水平以及心肌組織3-NT蛋白表達明顯升高（P<0.05, P<0.01）；與Model組比較， QLQX組顯著降低血漿8-iso-PGF2α、3-NT水平以及心肌組織3-NT蛋白表達（P<0.05, P<0.01）。

24、　　2.揭示芪藶強心膠囊能夠改善脂肪酸能量代謝
　　氣相色譜分析心肌組織多不飽和脂肪酸構成，血漿 FFA水平檢測及相關性分析結果顯示，與 Sham組比較，Model組大鼠心肌組織 n-6系PUFAs和血漿FFA顯著升高，n-3系PUFAs明顯降低（P<0.05，P<0.01），且FFA與n-6系PUFAs呈顯著正相關（P<0.001），與n-3系PUFAs（C18:3、C22:5）呈負相關（P<0.01），提示 PUFAs和 FF

25、A水平與慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關，n-6系PUFAs水平增高，釋放入血的FFA水平升高，細胞毒性增強，n-3系PUFAs水平下降，心肌組織不飽和脂肪酸構成紊亂。芪藶強心膠囊能夠明顯降低血漿FFA和心肌組織n-6系PUFAs水平，升高n-3系PUFAs水平（P<0.05，P<0.01），改善PUFAs構成和能量代謝，減少毒性脂質堆積，延緩慢性心力衰竭進程。
　　心肌組織脂肪酸轉位酶(FAT/CD36)、脂肪酸β氧化過程限速酶（C

26、PT-1）、脂肪酸合酶（FAS）、多聚(ADP-核糖)聚合酶-1（PARP-1）蛋白和mRNA水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組降低FAT、CPT-1蛋白和 mRNA表達，上調 FAS、PARP-1蛋白和 mRNA表達（P<0.05）；與 Model組比較，QLQX組不同程度的升高 FAT、CPT-1蛋白和mRNA表達，降低FAS、PARP-1蛋白和mRNA表達（P<0.05， P<0.01），揭示芪藶強心膠囊通過促進脂肪

27、酸轉運和利用，抑制脂肪酸合成，從而減少脂肪酸堆積，減輕心肌能量耗損和衰竭，改善心肌能量代謝。
　　3.揭示芪藶強心膠囊通過膽固醇調節(jié)元件結合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）/膽固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP-1c）/乙酰輔酶A羧化酶-1（ACC1）途徑調節(jié)膽固醇代謝
　　心肌組織SCAP/SREBP-1c/ACC1蛋白和mRNA水平檢測結果顯示，與Sham組比較，Model組不同程度的上調SCAP、SREBP-1c/p-SRE

28、BP-1c、ACC1/p-ACC1蛋白和/或 mRNA表達（P<0.01，P<0.05）；與 Model組比較，QLQX組降低SCAP、SREBP-1c/p-SREBP-1c、ACC1/p-ACC1蛋白和/或mRNA表達（P<0.05，P<0.01），提示慢性心力衰竭狀態(tài)下膽固醇合成過度激活，脂質合成增加，易產生心肌組織脂質堆積，引起脂毒性。芪藶強心膠囊可抑制膽固醇合成過度激活，改善脂質代謝， SCAP/SREBP-1c/ACC1途徑調

29、節(jié)膽固醇代謝可能是改善脂質代謝的重要機制之一。
　　4.證實芪藶強心膠囊通過 LOX和 COX兩種途徑改善脂質代謝，發(fā)揮防治慢性心力衰竭的作用
　　心肌組織15-脂氧化酶（15-LOX）、胞質型磷脂酶 A2（cPLA2）、p38絲裂原激活的蛋白激酶及其磷酸化（p38MAPK）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）蛋白和 mRNA水平檢測結果顯示，與 Sham組比較，Model組上調 cPLA2、p38MAPK及其磷酸化、COX-2蛋白

30、和/或 mRNA表達（P<0.01，P<0.05）；與Model組比較，QLQX組不同程度的降低cPLA2、p38MAPK及其磷酸化、COX-2蛋白和/或mRNA表達（P<0.01，P<0.05），提示慢性心力衰竭病理狀態(tài)下p38MAPK及其磷酸化通路激活LOX途徑，促進 cPLA2高表達，加重脂質過氧化狀態(tài)，COX-2途徑被激活，促進花生四烯酸（AA）合成前列腺素，誘導炎癥反應。芪藶強心膠囊能夠下調15-LOX、cPLA2、COX-2

31、蛋白和/或基因表達，抑制p38MAPK及其磷酸化通路，提示芪藶強心膠囊可通過LOX和COX兩種途徑改善脂質代謝。
　　小結：
　　慢性心力衰竭大鼠脂質過氧化及硝化應激反應增強，n-6系 PUFAs水平增高，脂肪酸堆積，釋放入血的FFA水平增高，細胞毒性增強，n-3系PUFAs水平下降，脂肪酸構成紊亂，膽固醇代謝、以及LOX和COX脂質代謝途徑過度激活，脂質合成增加引起脂質堆積。芪藶強心膠囊通過下調8-iso-PGF2α、3-

32、NT表達，抑制體內脂質過氧化和硝化應激反應，改善PUFAs構成和能量代謝，促進脂肪酸的轉運、攝取和利用，減少脂肪酸的合成和堆積，改善能量代謝，通過 SCAP/SREBP-1c/ACC1途徑調節(jié)膽固醇代謝，可通過p38MAPK及其磷酸化通路抑制LOX途徑和COX途徑激活，改善脂質代謝。
　　結論：
　　1.以脈絡學說為指導探討慢性心力衰竭中醫(yī)病機特點，指出營衛(wèi)失和、氣化失司導致的氣陽虛乏是其基本病機，陽氣失于溫煦，運血無力，瘀

33、血絡阻，津血互換障礙，導致痰瘀阻滯脈絡，津液不能回流聚于絡外，從而發(fā)為“氣分”、“血分”、“水分”病變，三者互患加重，日久結聚成形，導致絡息心積。據此確立“氣血水同治分消”治則，制定芪藶強心膠囊組方。
　　2.揭示慢性心力衰竭發(fā)展過程中心臟微血管內皮細胞和心肌細胞均出現損傷，RAAS系統(tǒng)激活，心室重構，心功能下降，腎臟水代謝障礙。芪藶強心膠囊可保護心臟微血管內皮細胞和心肌細胞超微結構，抑制RAAS系統(tǒng)激活和心室重構，通過eNOS/

34、sGC/cGMP/PKG途徑舒張血管，通過抑制AVP及其受體V2R、AQP2表達，改善腎臟水代謝，提高心功能，發(fā)揮“益氣溫陽、活血通絡、利水消腫”的作用，進一步佐證了脈絡學說防治慢性心力衰竭的重要價值。
　　3.采用代謝組學研究技術，利用生物信息學分析方法，揭示慢性心力衰竭發(fā)展過程中氨基酸、脂質能量等代謝紊亂，芪藶強心膠囊保護心臟微血管、抑制 RAAS系統(tǒng)激活、利尿、舒張血管的作用與脂質、溶血磷脂酸代謝顯著相關，提示芪藶強心膠囊抑

35、制脂類物質紊亂在延緩慢性心衰進程中起到重要作用，為復方中藥現代化研究提供了方法學借鑒。
　　4.揭示芪藶強心膠囊通過下調8-iso-PGF2α、3-NT表達，抑制體內脂質過氧化及硝化應激反應；通過改善心肌組織不飽和脂肪酸的構成，降低血漿 FFA水平，減少脂質堆積，通過促進脂肪酸的轉運、攝取和利用，從而減少心肌脂肪酸的合成和堆積，改善能量代謝；揭示芪藶強心膠囊可能通過 SCAP/SREBP-1c/ACC1途徑調節(jié)膽固醇代謝，可能通過