黃色粘球菌DK1622基因組的簡化.pdf

1、粘細(xì)菌是一類具有復(fù)雜多細(xì)胞社會學(xué)行為的革蘭氏陰性單細(xì)胞滑動細(xì)菌，能夠合成多種具有抗腫瘤、抗真菌、抗細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的天然產(chǎn)物。
　　 黃色粘球菌(Myxococcusxanthus，M.xanthus)DK1622是研究粘細(xì)菌多細(xì)胞群體行為以及遺傳與進(jìn)化的陸生模式菌株，屬于孢囊桿菌亞目的粘球菌屬，不含內(nèi)源性質(zhì)粒，染色體為一條環(huán)狀雙鏈DNA，基因組序列全長為9.14Mb左右。其多細(xì)胞群體行為主要表現(xiàn)為雙運動系統(tǒng)支配的滑行運

2、動、子實體發(fā)育及粘孢子形成、自然環(huán)境中的群體捕食行為等。
　　 纖維堆囊菌（Sorangiumcellulosum）屬于堆囊菌亞目的堆囊菌屬，具有迄今為止發(fā)表的最大的原核生物基因組，是粘細(xì)菌中次級代謝產(chǎn)物數(shù)量最多、種類最為豐富的一個菌種。合成的次級代謝產(chǎn)物幾乎占所有已發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌種類的一半，且?guī)缀?00％的菌株都具有合成生物學(xué)活性物質(zhì)的能力。
　　 埃博霉素(epothilone)即是纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合

3、物，具有促微管聚合活性，是繼紫杉醇之后發(fā)現(xiàn)的作用于微管的抗腫瘤化合物中最令人興奮的研究熱點之一，是極具潛力的抗癌藥物。但是由于纖維堆囊菌自身存在著代時長(16h)、遺傳操作體系不成熟及遺傳背景不清晰等限制性因素，它的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它藥源微生物，埃博霉素的生物發(fā)酵也難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。為了解決這個難題，研究人員嘗試對埃博霉素進(jìn)行了異源宿主表達(dá)，大腸桿菌、鏈霉菌、粘球菌因其代時短、遺傳背景清晰以及具有合成產(chǎn)物所需的底物和輔助酶等特點，常

4、被當(dāng)做埃博霉素的異源表達(dá)載體。而作為異源表達(dá)的合適的“底盤”細(xì)胞，應(yīng)具有精簡、健壯的基因組結(jié)構(gòu)，即“最小”基因組，從而最大程度的降低噪聲干擾，從而提高所設(shè)計系統(tǒng)的可控性和可操作性。
　　 最小基因組是指在最適宜條件下維持細(xì)胞生長繁殖所必需的最小數(shù)目的基因，因此最小基因組研究的核心是確定基因的必需性。根據(jù)基因必需性的信息，可以采取“自上而下，top-down”的策略對現(xiàn)有的基因組進(jìn)行有目的的精簡，刪除非必需的基因組片段。其中，用于

5、研究必需基因的方法主要有比較基因組學(xué)、大規(guī)?；蚴Щ顚嶒炓约盎诖x網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測方法等。而在基因組精簡研究方面，目前的研究方法主要有基于自殺質(zhì)粒的同源重組方法、基于線性DNA的同源重組方法、基于位點特異性重組酶的方法和基于轉(zhuǎn)座子的方法等。
　　 基于以上的研究背景和思路，為了能夠?qū)崿F(xiàn)埃博霉素類化合物合成酶基因簇在粘細(xì)菌中的高效表達(dá)，我們嘗試用合成生物學(xué)最小基因組的理論方法來構(gòu)建適于次級代謝產(chǎn)物表達(dá)的粘細(xì)菌底盤生物。
　　

6、首先，為了尋找DK1622基因組的非必需基因，我們通過生物信息學(xué)手段依次對DK1622基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，水平轉(zhuǎn)移而來的基因組島的預(yù)測以及次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的預(yù)測等分析。其中，通過比較基因組學(xué)的方法確定的黃色粘球菌DK1622的共有基因為:與另外兩種粘球菌(HW-1、124B02)比較，三者共有的基因數(shù)為5223個，占整個DK1622基因組的71.4％;與另外的10種粘細(xì)菌基因組(M.fulvusHW-1，M.fulvus

7、124B02，S.cellulosumSo0157-2,S.cellulosumSoce56,S.aurantiacaDW4/3-1,HaliangiumochraceumDSM14365,Anaeromyxobactersp.Fw109-5,Anaeromyxobactersp.K,Anaeromyxobacterdehalogenans2CP-C,Anaeromyxobacterdehalogenans2CP-1)比較，11種粘細(xì)菌

8、共有的基因數(shù)為955個，占整個DK1622基因組的12.03％。通過生物信息學(xué)軟件IslandViewer和IslandPath，我們在DK1622基因組中預(yù)測得到了19個通過水平轉(zhuǎn)移而來的基因組島，約占DK1622基因組全長的4.5％（李霞碩士完成）。通過生物信息學(xué)次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇預(yù)測軟件antiSMASH，我們在DK1622基因組中預(yù)測得到了22個次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇，片段大小總長度為1，283，071bp，約占DK

9、1622基因組全長的14％。
　　 隨后，為了進(jìn)一步確定預(yù)測得到的基因組島和次級代謝產(chǎn)物合成基因簇是否真為黃色粘球菌DK1622的非必需基因，我們對基因組島（李霞碩士完成）和次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行了逐個敲除，并對得到的敲除突變株的基本性質(zhì)進(jìn)行了分析。在確認(rèn)了它們的非必需性后，我們對預(yù)測得到的基因組島進(jìn)行了連續(xù)敲除，從而對黃色粘球菌DK1622基因組進(jìn)行簡化，以期得到適于次級代謝產(chǎn)物表達(dá)的粘細(xì)菌的底盤生物。
　　 其中

10、，我們共得到了GI01-03、GI01-04雙缺失突變株，GI01-03-05三缺失突變株以及GI01-03-05-16四缺失突變株。基因組缺失片段大小分別為74689bp，54842bp，98923bp，131251bp。其中，四缺失突變株GI01-03-05-16的缺失片段大小占預(yù)測得到的基因組島總片段的34.91％，占整個DK1622基因組約1.44％。對連續(xù)敲除突變株的基本性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)敲除突變株的生長能力、運動能力和捕食能

11、力相較野生菌株DK1622沒有明顯的變化，而子實體發(fā)育和生孢能力相較于野生菌株DK1622則有較明顯變化:其中，連續(xù)敲除突變株GI01-03生孢能力約為野生菌株的23％;GI01-03-05、GI01-03-05-16的生孢能力略有降低;GI01-04的生孢能力基本不變。
　　 另外，對次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的必需性分析實驗中，我們共得到次級代謝產(chǎn)物合成基因簇敲除突變株4株(S6、S9、S12、S17)，并對得到敲除突變株的基本