基因組學分析糞腸球菌益生功能及增殖調控研究.pdf

1、益生菌能夠維持和改善腸道微生物的平衡并且對宿主具有多種有益影響，為了能夠發(fā)揮其功能，益生菌要能夠耐受胃腸道的“惡劣環(huán)境”，并能夠定植在腸道中。益生菌的益生性具有菌株特異性，然而目前國內(nèi)益生菌制劑僅有菌種名稱，沒有菌株的具體功能特性信息和遺傳背景信息，更沒有菌株的全基因組信息。因此，本研究通過體外試驗和比較基因組學分析相結合的方法，對糞腸球菌菌株的益生性和安全性進行評價，為益生菌制劑的開發(fā)奠定理論和應用基礎。本文首先對分離自傳統(tǒng)乳制品中能

2、顯著抑制致病菌的乳酸菌進行了篩選和鑒定，隨后結合比較基因組學和藥物敏感性實驗對糞腸球菌的潛在益生性和安全性進行了關聯(lián)分析，最后基于轉錄組學和代謝產(chǎn)物分析對糞腸球菌有氧呼吸條件下糖代謝途徑的研究結果優(yōu)化其增殖條件實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。
　　從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到116株乳酸菌，通過體外實驗篩選得到4株產(chǎn)細菌素的乳酸菌菌株。隨后對這4株菌的酸耐受能力、膽鹽耐受能力和黏附能力進行研究，最終確定Enterococcus faecalis L

3、D33可做為潛在的益生菌應用，并對其所產(chǎn)細菌素進行了初步純化，利用Tricine-SDS-PAGE電泳確定其分子量約為10 KDa，且具有相對較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。
　　以E. faecalis LD33菌株為目的菌株，通過全基因組測序獲得其基因組完成圖。隨后比較基因組學分析表明，其染色體上不但具有同酸耐受性和膽鹽耐受性密切相關的ATPase、Na+/H+逆向轉運蛋白、膽鹽水解酶、環(huán)丙烷脂酰磷脂合成酶以及多個雙組分調控系統(tǒng)的

4、編碼基因，而且還具有同黏附作用相關的黏附素蛋白、纖連蛋白、細胞表面蛋白、轉肽酶和延長因子結合蛋白編碼基因。此外，還具有一個由雙組分調控系統(tǒng)、ABC型抗菌肽轉運通透酶和細菌素編碼基因構成的細菌素合成基因簇。這些功能基因恰好能夠與體外實驗結果E. faecalis LD33的良好酸耐受、膽鹽耐受能力和黏附性以及對致病菌的抑制作用相互驗證。比較基因組分析還發(fā)現(xiàn)E. faecalisLD33的染色體上無致病性毒力因子的編碼基因且不具備通過基因島

5、、質粒等可移動基因元件來傳播藥物抗性的基本條件，抗生素敏感性測試實驗表明其僅對氨基糖苷類抗生素及利福平具有抗性，可以作為益生菌來安全使用。
　　通過轉錄組測序技術對發(fā)酵和有氧呼吸代謝條件下的E. faecalisLD33呼吸鏈和糖代謝相關基因的表達差異進行分析，發(fā)現(xiàn)E. faecalisLD33呼吸鏈編碼基因屬于組成型表達，與其是否進行有氧呼吸代謝無關，結合代謝產(chǎn)物分析結果發(fā)現(xiàn)當其進行有氧呼吸代謝時，其通過增加丙酮酸代謝通路和丁酸

6、代謝通路中gap、pdh、eutD、ackA、alsS和butA基因的表達量，降低ldh基因的表達量來改變葡萄糖的代謝途徑，使碳水化合物代謝的主要終產(chǎn)物由乳酸變成乳酸、乙酸和乙偶姻，當葡萄糖被耗盡之后它能夠通過代謝其他碳水化合物和氨基酸來繼續(xù)增殖，從而獲得更高的生物量和極強的長期存活率?；谝陨限D錄組和代謝產(chǎn)物分析結果對E. faecalisLD33高密度培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后E. faecalis LD33培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)可以達