糞腸球菌噬菌體IME-EF3的分離鑒定及其全基因組分析.pdf

1、目的：利用醫(yī)院污水分離到臨床耐藥糞腸球菌的噬菌體 IME-EF3，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析，深入探索其基因組學(xué)特征，為噬菌體制劑個(gè)體化治療耐藥糞腸球菌感染及利用噬菌體消除耐藥糞腸球菌污染提供應(yīng)用基礎(chǔ)。
　　方法：采集醫(yī)院污水，經(jīng)污水富集法分離噬菌體，以糞腸球菌臨床耐藥分離株為宿主菌。經(jīng)雙層平板法確定噬菌斑形態(tài)及大小，連續(xù)三次鋪板法純化后測(cè)定其宿主譜范圍、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)溫度、紫外照射對(duì) IME-EF3活性的影響。取

2、適量噬菌體液經(jīng)DNase I與RNase A消化，利用蛋白酶K/SDS法提取其基因組，并對(duì)其進(jìn)行酶切處理，確定其遺傳物質(zhì)的組成以及形態(tài)。利用第二代測(cè)序技術(shù)Ion Torrent測(cè)IME-EF3的基因組全序，獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，利用生物信息學(xué)軟件 SOAPdenovo進(jìn)行序列拼接，而后用生物信息學(xué)軟件 Velvet、ABYSS、CLC genomics workbench3進(jìn)行序列拼接驗(yàn)證，證明拼接正確后，再利用生物信息學(xué)軟件 Kodon

3、進(jìn)行 IME-EF3全基因組中 ORFs的預(yù)測(cè)。在 European Molecular Biology Laboratory（EMBL）網(wǎng)站上將利用 Kodon預(yù)測(cè)出的所有 ORFs與噬菌體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用軟件 Mega5對(duì)其進(jìn)行分析并構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析與已知噬菌體的進(jìn)化關(guān)系。利用CLC genomics workbench3對(duì)金屬β內(nèi)酰胺酶基因分析，上傳 IME-EF3的氨基酸序列至 PHACTS，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4、結(jié)合驗(yàn)證其是否為裂解性噬菌體。
　　結(jié)果：成功分離到一株裂解性糞腸球菌噬菌體 IME-EF3，其噬菌斑邊緣清晰,斑體透明,直徑約1.7 mm,噬菌體效價(jià)為4.4×108 pfu/ml。IME-EF3對(duì)株糞腸球菌563菌株,及384菌株有裂解能力，能長(zhǎng)出明顯的噬菌斑，而對(duì)其他菌株不敏感，說(shuō)明其宿主專一性強(qiáng)。IME-EF3最佳感染復(fù)數(shù)為1，通過(guò)一步生長(zhǎng)曲線測(cè)得 IME-EF3的潛伏期為10-20 min，20-55 min里噬菌體爆發(fā)

5、性生長(zhǎng)，60 min后噬菌體生長(zhǎng)進(jìn)入爆發(fā)末期。其感染宿主菌的裂解量是75。電鏡下IME-EF3為蝌蚪形狀，頭部寬60nm，長(zhǎng)約50nm，尾部長(zhǎng)約200nm，典型的長(zhǎng)尾結(jié)構(gòu)，為長(zhǎng)尾噬菌體。其熱穩(wěn)定性較好，對(duì)紫外線敏感。基因組酶切分析顯示其遺傳物質(zhì)為雙鏈 DNA，經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接，IME-EF3基因組為41,119bp，G/C含量為34.6％。注釋后可知其有69個(gè)CDS，其中有33個(gè)注釋出了功能。共分為7個(gè)組分。對(duì)其裂解酶、宿主特異蛋白及末端酶

6、大亞基的進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其與糞腸球菌噬菌體 efaCPT1，EFAP-1親緣性近。利用PHACTS對(duì)IME-EF3氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其為裂解性噬菌體，此結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。IME-EF3具有末端酶大亞基和小亞基，通過(guò)在特定的序列附近進(jìn)行酶切，產(chǎn)生末端正向重復(fù)序列，IME-EF3同時(shí)具有左側(cè)及右側(cè)末端序列，這表明 IME-EF3為含有末端冗余的線性基因組（含有568bp末端重復(fù)序列）。對(duì)金屬β內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與糞腸

7、球菌噬菌體EfaCPT1的金屬β內(nèi)酰胺酶序列最為接近，兩者同源的氨基酸序列為86%。
　　結(jié)論：利用醫(yī)院廢水成功分離到裂解性噬菌體 IME-EF3，通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性的分析后發(fā)現(xiàn)其爆發(fā)力強(qiáng)，潛伏期短，高裂解性，具有較好的熱穩(wěn)定性，可能用于臨床治療，通過(guò)對(duì) IME-EF3基因組的分析，我們發(fā)現(xiàn)其具有金屬β內(nèi)酰胺酶基因，所以，在噬菌體投入臨床治療之前，測(cè)定全基因組序列是十分必要的，IME-EF3含有金屬β內(nèi)酰胺酶基因，在投入臨床之前，