再治療根管內(nèi)糞腸球菌的分離鑒定及其熒光蛋白穩(wěn)定標記載體的構建.pdf

1、牙髓根尖周疾病是一種口腔常見疾病，目前而言根管治療是其首選治療方法。原則上來講，完善的根管治療可以促進根尖周病變的愈合，但是臨床上仍有一部分失敗病例，研究發(fā)現(xiàn)其主要原因是根管內(nèi)細菌的持續(xù)性存在；而在對根管再感染病例的研究中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌又以其高檢出率引起關注。
　　糞腸球菌屬于鏈球菌科、腸球菌的一種，是人類口腔、腸道常駐菌；其具有一些特殊能力，如侵入牙本質(zhì)小管、對氫氧化鈣等一般抗菌藥物耐受、抗饑餓能力以及單獨形成生物膜能力。憑借其

2、特殊能力，它在根管再感染中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)其在根管再感染中的檢出率遠大于在原發(fā)性感染中，已有大量學者研究其在再治療根管中的分離率，但是究竟其高檢出率是否與患者個體因素、患牙情況、治療時間長短等因素有關？不同分離株生物特性是否一致？值得研究分析。本實驗以根管治療后再感染病人為研究對象，收集樣本，分離鑒定，研究其生物學特性，為臨床徹底消除糞腸球菌造成的再感染提供依據(jù)。
　　另外，目前對和糞腸球菌生物膜形成有關的毒力因子已有很多研

3、究，如ESP、GelE、SprE、frs等，本實驗研究中發(fā)現(xiàn)一種和生物膜形成相關的新基因 bfrg，該基因被突變后，糞腸球菌生物膜的形成量顯著降低。為更好研究觀察生物膜動態(tài)形成過程，構建糞腸球菌綠色熒光蛋白穩(wěn)定表達載體這一有力工具成為必要。實驗分以下四個部分：
　　一、再治療根管內(nèi)糞腸球菌的采集分離鑒定
　　本實驗收集臨床病例樣本54例應用特異性較高的糞腸球菌選擇性培養(yǎng)基與糞腸球菌瓊脂分離培養(yǎng)；應用16SrRNA技術從基因水

4、平上對分離株進行鑒定，以再治療根管為對象，進而研究不同宿主、不同微環(huán)境下糞腸球菌的檢出率。54例臨床病例中有18例分離鑒定出糞腸球菌，檢出率為33.3％。經(jīng)統(tǒng)計分析：再治根管內(nèi)糞腸球菌的檢出率在患者性別、年齡、患牙根尖周陰影大小及距離上次根管治療時間長短等方面無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；但與上次根管治療根充是否到位有關，欠填根管中糞腸球菌的檢出率明顯高于恰填根管中糞腸球菌的檢出率，有統(tǒng)計學差異（P<0.05），而不同欠填長度組間糞腸球

5、菌的檢出率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。說明糞腸球菌在根管再感染中還是有較高的檢出率；而且臨床中欠填比恰填更容易引起糞腸球菌再感染根管，提示為防止根管再感染，臨床根管治療中更應當把根管適當?shù)某涮钪匾暺饋怼?br>　　二、糞腸球菌分離株生物特性的研究
　　本實驗以實驗一獲得的18株糞腸球菌分離株為對象以標準株（ATCC29212）為對照，研究其生物學特性。1.分別通過鋪板計數(shù)法和測OD值法對比其生長曲線；2.通過96孔板培養(yǎng)CV染色

6、測OD法對比其生物膜形成能力；3.通過2倍稀釋比濁法測MIC對比其對幾種常用抗生素的耐藥性。結果顯示：對照株及各臨床分離株生長曲線測定15h，0-4h為恢復期，4-12h為對數(shù)生長期，12h以后達到平臺期（P＞0.05），對照株及分離株各時間點 OD600值及細菌濃度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；對照組及各臨床分離株對氨芐青霉素、卡那霉素及萬古霉素敏感，對四環(huán)素和紅霉素有一定的耐藥性，但各菌株間無統(tǒng)計學差異；標準株及各臨床分離株均可形成

7、生物膜，但標準株及臨床分離株OD570值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，即各菌株生物膜形成量無顯著性差異。說明各個分離株與對照株生長特性無顯著差異，糞腸球菌對萬古霉素較為敏感。
　　三、與生物膜形成相關的bfrg基因的發(fā)現(xiàn)
　　本實驗用EZ-Tn5 DHFR-1 Tnptransposome轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化E.faecalis菌，構建了E.faecalis菌的突變菌庫，用結晶紫（CV）、Syto9、FDA三種不同的染色方法篩選生物膜

8、形成缺陷的突變菌株，進而克隆并獲得引起細菌生物膜形成顯著降低的突變基因，發(fā)現(xiàn)一個功能未知的基因在被突變后，E.faecalis菌的生物膜形成能力顯著降低，將其命名為生物膜形成相關基因（bfrg基因）。結果顯示：與對照的野生型E.faecalis菌相比，bfrg基因突變菌株形成的細菌生物膜無論在總量上還是在其活細胞含量上，都顯著降低（超過50％）；糞腸球菌bfrg基因突變后，其形成的15h生物膜與野生型細菌相比，在綠色熒光強度、生物膜總體

9、積、表面積以及最大生物膜厚度等指標均顯著降低；而在生物膜孔隙率、粗糙度等方面顯著增加。說明bfrg基因突變后，糞腸球菌的生物膜形成量顯著降低，厚度減小，內(nèi)部的空隙變大， bfrg基因可能對生物膜形成有促進作用。
　　四、糞腸球菌熒光基因穩(wěn)定表達載體的構建
　　本實驗以pFW5這一細菌常用自殺載體為骨架，選取糞腸球菌上保守基因乳酸脫氫酶為靶點，分別設計兩對引物PCR擴增目的片段pus、pds連入pFW5；為了利用載體pUC18