基于半抗原抗體技術(shù)研究人參皂苷在腦組織內(nèi)的分布.pdf

1、目的:目前國(guó)內(nèi)外大量研究均證明人參的有效成分人參皂苷對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有肯定的藥理作用。基于人參的這種中樞活性，人參皂苷能否透過血腦屏障(BBB)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。大多數(shù)研究學(xué)者們認(rèn)為人參皂苷不能透過BBB，但也有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為人參皂苷可透過BBB?；诋?dāng)前的這種研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬采用腦組織勻漿和腦脊液高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)檢測(cè)技術(shù)和腦組織切片免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)分析技術(shù)，再次回答這個(gè)科學(xué)問題。且如果不能透過，是否能到

2、達(dá)BBB;如果能，可具體分布于BBB的哪些細(xì)胞中。通過回答上述科學(xué)問題，將有助于探討人參皂苷中樞活性的作用機(jī)理，并為研究其中樞作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)1:高純度人參總皂苷的制備
　　本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂D101聯(lián)用陰陽離子交換樹脂制備高純度人參總皂苷，并通過香草醛-硫酸比色法和電噴霧檢測(cè)器(CAD)柱后流動(dòng)相補(bǔ)償一測(cè)總評(píng)法對(duì)皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定。
　　實(shí)驗(yàn)2:人參皂苷半抗原抗體的制備與純化

3、
　　首先用以上所得高純度人參皂苷偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)，得到人參皂苷半抗原，SDS-PAGE凝膠電泳檢驗(yàn)是否偶聯(lián)成功;再以偶聯(lián)成功的人參皂苷-BSA免疫兔子，獲得抗血清;然后通過硫酸銨沉淀、蛋白A柱純化、抗原柱純化，得效價(jià)較高的抗人參皂苷抗體;最后酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)，生物膜層干涉技術(shù)測(cè)定人參皂苷各單體與抗人參皂苷抗體之間的親和力，免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)一步檢測(cè)抗體的有效性。
　　實(shí)驗(yàn)3:液質(zhì)聯(lián)用(LC-

4、MS)檢測(cè)腦組織及腦脊液中的人參皂苷
　　小鼠人參皂苷灌胃1周，取全腦，制備腦組織勻漿，勻漿液固相萃取預(yù)處理后，LC-MS檢測(cè)人參皂苷。大鼠人參皂苷給藥1周，取腦脊液，LC-MS檢測(cè)人參皂苷含量。
　　實(shí)驗(yàn)4:免疫組織化學(xué)法(IHC)測(cè)定人參皂苷在腦組織內(nèi)的分布
　　首先采用免疫組織化學(xué)的方法研究人參皂苷是否能在腦冰凍切片組織中被檢出。然后，采用免疫熒光雙染法，使用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神

5、經(jīng)元神經(jīng)元標(biāo)志物特異性核蛋白(NEUN)、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物血管性假血友病因子(VWF)兩兩聯(lián)用，研究人參皂苷在這些細(xì)胞中是否有陽性顯色。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)1:人參皂苷樣品中含單體皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rg1、Rg2、Rg3、Rc、Rd、Re、Rf、 Rh1、F2、F3，香草醛-硫酸比色法測(cè)得總皂苷含量為101.8±2.5％，一測(cè)總評(píng)法測(cè)得總皂苷含量為75％，非皂苷類成分約25％。
　　實(shí)驗(yàn)2:SDS-PAG

6、E凝膠電泳分析人參皂苷-BSA條帶略高于BSA條帶，說明人參皂苷與BSA偶聯(lián)成功;ELISA檢測(cè)純化后的抗體效價(jià)及特異性都較好;生物膜層干涉技術(shù)測(cè)得抗人參總皂苷抗體與人參總皂苷、人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rh2、原人參二醇、F1、化合物K、原人參三醇的親和力分別為3.99×10-7、4.69×10-9、2.59×10-9、2.40×10-6、1.62×10-4、2.64×10-7、1.66×10-10、1.08×10-7和1.32×

7、10-6;免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示抗體在人參總皂苷孵育的細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)陽性染色。
　　實(shí)驗(yàn)3:LC-MS在腦組織勻漿液中能檢測(cè)到人參皂苷Rg1，LC-MS在腦脊液中沒有檢測(cè)到人參皂苷。
　　實(shí)驗(yàn)4:IHC在腦組織切片中能檢測(cè)到人參皂苷，并能被游離的人參皂苷所阻斷;免疫熒光雙染法在血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到人參皂苷，大多數(shù)神經(jīng)元中沒有檢測(cè)到人參皂苷，少數(shù)神經(jīng)元中能檢測(cè)到人參皂苷。
　　結(jié)論:1.人參皂苷能到達(dá)BBB，可分布