超高靈敏流式檢測(cè)儀的多方位改進(jìn)及其在化學(xué)生物學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)是一種對(duì)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速定量分析和分選的先進(jìn)技術(shù)。然而,傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀難以檢測(cè)粒徑小于0.5微米或者亮度少于幾百個(gè)熒光素分子的顆粒。自然界中存在著眾多的生物納米顆粒,如細(xì)菌、病毒、線粒體、分子組裝體、生物大分子等,它們的尺寸均在納米至亞微米范圍。此外,隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,納米顆粒(如納米金、量子點(diǎn)、磁性納米顆粒、納米乳膠微球等)被廣泛地應(yīng)用于標(biāo)記、運(yùn)載、治療、傳感、

2、分離以及純化等生物技術(shù)領(lǐng)域。納米顆粒以及納米生物的單個(gè)分析可揭示因集權(quán)平均而被掩蓋的個(gè)體差異,獲得顆粒的性狀分布圖,考察個(gè)體對(duì)于整體的貢獻(xiàn)。因此,發(fā)展先進(jìn)的單個(gè)納米顆粒分析技術(shù),快速、靈敏地對(duì)納米顆粒的尺寸、濃度及生化特性等進(jìn)行同時(shí)表征,對(duì)于化學(xué)生物學(xué)研究具有重要意義。本論文以本人碩士階段搭建的單熒光通道超高靈敏流式檢測(cè)儀(High sensitivity flowcyotmter,HSFCM)為基礎(chǔ),通過(guò)多方位的儀器改進(jìn),應(yīng)用于化學(xué)生

3、物學(xué)研究的不同檢測(cè)體系。
　　 本論文主要包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容:
　　 第一章為文獻(xiàn)綜述。主要介紹流式細(xì)胞術(shù)的概念、歷史、新型流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展以及在微生物學(xué)中的應(yīng)用。在本章最后部分介紹本論文的選題思路以及研究?jī)?nèi)容。
　　 第二章為HSFCM應(yīng)用于單個(gè)納米顆粒的檢測(cè)。將單熒光通道HSFCM改進(jìn)為側(cè)向散射光和橙色熒光信號(hào)同時(shí)檢測(cè)的雙通道HSFCM:采用532 nm激光器作為光源且功率控制在0.75 mW,側(cè)向散射

4、光和橙色熒光信號(hào)分別由光電倍增管(PMT)和單光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器(APD)檢測(cè)。HSFCM的熒光通道可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)藻紅蛋白熒光信號(hào)的檢測(cè),信噪比約為17。散射光通道可以明確地檢出直徑為100 nm的單個(gè)聚苯乙烯納米球,且對(duì)不同大小的聚苯乙烯納米粒子具有優(yōu)良的分辨率。使用雙通道HSFCM對(duì)210 nm熒光納米顆粒進(jìn)行無(wú)標(biāo)樣的絕對(duì)計(jì)數(shù),定量檢測(cè)得到的濃度與廠家的報(bào)告濃度具有良好的相關(guān)性(R2>0.99),而且在所測(cè)濃度范圍內(nèi)(1.62x105～3

5、.93×107particles／mL)檢測(cè)效率達(dá)90％。對(duì)含有不同比例的熒光納米顆粒和非熒光納米顆粒的混合物進(jìn)行檢測(cè),取得了與理論值非常一致的結(jié)果。此外,對(duì)攜載阿霉素的370 nm ZrO2納米顆粒和熒光染色的細(xì)菌E.coli ER2738的檢測(cè)表明雙通道HSFCM可應(yīng)用于不同材料納米粒子的分析。
　　 第三章為HSFCM應(yīng)用于致病菌與總菌數(shù)目的同時(shí)檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)致病菌與總菌數(shù)的同時(shí)檢測(cè)與定量分析,將HSFCM改進(jìn)為雙熒光檢測(cè)通

6、道:采用488 nm激光器作為光源且功率控制在1.0 mW,更換二向色濾光片和帶通濾光片將檢測(cè)通道改進(jìn)為綠色熒光和紅色熒光雙通道,且熒光信號(hào)分別由兩個(gè)單光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器(APD)檢測(cè)。以致病菌E.coli O157:H7和非致病菌E.coli DH5α作為檢測(cè)模型,優(yōu)化了熒光探針的選擇及染色方案,建立了細(xì)菌的核酸染色檢測(cè)體系和致病菌的單克隆抗體-生物素-親和素級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)體系。對(duì)抗體單染或抗體與核酸共染的致病菌E.coli O157:H7

7、以及雙染的非致病菌E.coli DH5α分別進(jìn)行檢測(cè)與定量,計(jì)數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法均具有很好的一致性,檢測(cè)限約為105cells／mL。對(duì)于含有不同配比E.coli O157:H7和E.coli DH5α的細(xì)菌混合樣品的檢測(cè)也取得了與理論值非常一致的結(jié)果。將抗體與核酸共染的雙熒光法應(yīng)用于天然礦泉水中致病菌的檢測(cè),結(jié)合離心富集法可使檢測(cè)限降低到102 cells／mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSFCM在致病菌的快速鑒定與定量分析方面具有巨大的應(yīng)

8、用潛力。
　　 第四章為HSFCM應(yīng)用于單細(xì)菌水平低豐度β-半乳糖苷酶的檢測(cè)。為利用熒光底物FDG實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)菌中低表達(dá)β-半乳糖苷酶的檢測(cè),將HSFCM改進(jìn)為側(cè)向散射光和綠色熒光同時(shí)檢測(cè)的雙通道:采用488 nm激光器作為光源且功率控制在1.0 mW,側(cè)向散射光和綠色熒光信號(hào)分別由光電倍增管(PMT)和單光子計(jì)數(shù)檢測(cè)器(APD)檢測(cè)。以轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pUC18的大腸桿菌E.coli JM109為檢測(cè)模型；在沒(méi)有誘導(dǎo)劑條件下,由于存

9、在大量阻遏蛋白而使得重組E.coliJM109表達(dá)低拷貝的β-半乳糖苷酶。利用FDG對(duì)細(xì)菌中低水平表達(dá)的β-半乳糖苷酶染色,通過(guò)優(yōu)化染色條件,在HSFCM上獲得了較好的綠色熒光信號(hào)。結(jié)合MUG定量法確定了單個(gè)重組E.coli JM109細(xì)菌在沒(méi)有誘導(dǎo)劑存在的情況下β-半乳糖苷酶的本底表達(dá)拷貝數(shù)在92～179之間。
　　 第五章為HSFCM應(yīng)用于單細(xì)菌水平自發(fā)熒光的檢測(cè)與定量。為保證較寬的信號(hào)檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍以及靈敏度的可調(diào)性,HSF

10、CM的側(cè)向散射光和綠色熒光檢測(cè)通道的檢測(cè)器均更換為線性范圍較寬的PMT；為了提高對(duì)弱熒光信號(hào)的檢測(cè),將488 nm激發(fā)光源的功率提高到4.5 mW。通過(guò)與不同大小聚苯乙烯納米顆粒的信號(hào)比較以及連二亞硫酸鈉的細(xì)菌自發(fā)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)(核黃素及其衍生物FAD和FMN的可逆氧化-還原性),證實(shí)HSFCM可明確地檢測(cè)到單個(gè)細(xì)菌的自發(fā)熒光信號(hào),而且這些熒光信號(hào)主要來(lái)源于細(xì)菌中氧化型的黃素類(lèi)物質(zhì)。利用三種FITC當(dāng)量已知的商品化熒光納米顆粒繪制FITC

11、當(dāng)量與信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)8種細(xì)菌的自發(fā)熒光分別進(jìn)行了定量分析。此外,通過(guò)不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)菌自發(fā)熒光的變化證明了FAD和FMN等核黃素類(lèi)物質(zhì)的含量和氧化還原狀態(tài)與細(xì)菌代謝以及生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。
　　 第六章為HSFCM應(yīng)用于單細(xì)菌水平EGFP基因表達(dá)的快速監(jiān)測(cè)。采用側(cè)向散射光和綠色熒光雙通道的HSFCM對(duì)E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP和E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-3

12、2a(+)-EGFP兩種體系中不同調(diào)控條件下的EGFP融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行快速監(jiān)測(cè)。與耗時(shí)長(zhǎng)且操作繁瑣的SDS-PAGE檢測(cè)法相比,HSFCM可以明顯檢測(cè)到E.coli BL21(DE3)／pET-32a(+)-EGFP體系中本底表達(dá)的EGFP融合蛋白以及較嚴(yán)謹(jǐn)E.coli BL21(DE3)pLysS／pET-32a(+)-EGFP體系中低IPTG誘導(dǎo)下低表達(dá)水平的EGFP融合蛋白。此外,HSFCM還可以對(duì)不同濃度IPTG誘導(dǎo)下的EGF