超高靈敏流式分析技術在單線粒體檢測中的應用.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩123頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、線粒體是細胞生命活動的控制中心,它不僅是細胞的能量中心,而且在多種誘因引發(fā)的細胞凋亡信號轉導中起著重要的調節(jié)作用。以線粒體為切入點的信號轉導研究,無論對于揭示細胞凋亡發(fā)生過程的分子機制,還是研究小分子化合物誘導腫瘤細胞凋亡的作用機理,均具有重要價值。與全細胞分析相比,單個線粒體水平上的分析能夠排除其他細胞器的干擾,揭示線粒體功能之間的異質性,并有助于線粒體亞類的發(fā)現。然而,由于線粒體尺寸微小,與其功能相關的生化物質含量低以及缺乏靈敏的檢

2、測手段等原因,單個線粒體水平上的檢測一直以來都是一個富有挑戰(zhàn)性的課題。
  本課題組自行研制的超高靈敏流式檢測儀(High-sensitivity flow cytometer,HSFCM),其靈敏度可達商品化流式細胞儀的數百倍以上,己在單個納米顆粒水平的檢測以及多個化學生物學體系中突顯獨特的應用價值。本論文主要基于HSFCM的靈敏度,建立一個能在單細胞器水平對線粒體進行多參數分析的平臺。文中首先利用熒光探針對線粒體內膜、核酸進行

3、標記,在HSFCM上建立了單個線粒體的檢測模式;進而采用免疫熒光的方法對線粒體蛋白進行標記,利用HSFCM嘗試了單線粒體水平的蛋白檢測;并在此基礎上,利用三通道的HSFCM開展了單個線粒體的多參數分析,在線粒體水平實現了對其純度、結構和功能完整性的全面考察。最后在全面建立的多參數分析平臺上,將體系進一步推廣至凋亡相關蛋白的檢測,并初步開展了抗腫瘤藥物作用機理的研究,主要內容如下:
  1.建立以HeLa腫瘤細胞為模型的線粒體提純方

4、法,采用綠色熒光探針NAO對線粒體內膜上的心磷脂進行特異性標記,利用HSFCM實現了對單個線粒體的檢測;采用紅色熒光探針SYTO62對線粒體的核酸進行標記,嘗試用NAO和SYTO62兩種熒光探針對線粒體進行同時標記,在HSFCM上初步建立了單個線粒體的檢測模式(第二章)。
  2.采用免疫熒光的方法對線粒體的外膜穿孔蛋白(porin)進行標記,優(yōu)化線粒體膜蛋白檢測的染色方案;通過優(yōu)化免疫熒光的樣品制備如細胞器的固定、打孔條件等,以

5、位于線粒體內膜及膜間隙的細胞色素c蛋白(cyt c)為模型,建立了適用于線粒體內部蛋白的免疫熒光標記方法,從而為HSFCM應用于單個線粒體水平的線粒體蛋白檢測奠定了基礎(第三章)。
  3.在已經建立的線粒體特異性生化物質熒光標記、線粒體蛋白免疫熒光標記和相應檢測模式基礎之上,將三通道HSFCM應用于單個線粒體的多參數分析。利用HSFCM檢測NAO和SYTO62熒光探針同時標記的線粒體,實現了對單個線粒體純度和結構完整性的考察;對

6、線粒體的porin和cyt c同時進行免疫熒光標記,利用HSFCM實現了對單個線粒體功能完整性的考察;并在線粒體水平考察了Ca2+刺激所引起的細胞色素c的釋放和線粒體的外膜損傷(第四章)。
  4.鑒于Bcl-2家族蛋白在線粒體介導的細胞凋亡中發(fā)揮的重要作用,我們利用HSFCM,在線粒體水平對凋亡相關蛋白Bax及Bcl-2進行了半定量檢測,并以此為基礎,初步開展了線粒體凋亡通路相關抗腫瘤藥物如:星形孢菌素、樺木酸等作用機理的研究(

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論