抗畜禽支原體中藥復方肺康明顆粒劑的研制及其化學成分研究.pdf

1、支原體導致的豬支原體肺炎、雞毒支原體病、牛傳染性胸膜肺炎和山羊傳染性胸膜肺炎給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。由于目前支原體疫苗的免疫接種效果欠佳，獸醫(yī)臨床常用的泰樂菌素等抗菌藥物耐藥性嚴重和藥物殘留問題被普遍關注，急需開發(fā)廉價、高效、廣譜、無毒的中藥復方抗畜禽支原體制劑。為進一步研制抗畜禽支原體中藥復方，本課題在前期工作基礎上選取南藥兩面針、廣藿香、南板藍根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮、艾葉等10味中藥，通過體外微量藥敏試驗，結(jié)

2、合中獸醫(yī)理論基礎和中藥藥劑學理論，篩選出有效的抗畜禽支原體單味中藥及最佳中藥復方，通過藥效學試驗評價最佳中藥復方的安全性和臨床療效，并將其制成中藥復方顆粒劑，同時對該復方顆粒劑進行質(zhì)量標準、初步穩(wěn)定性及其化學成分研究。具體研究方法與結(jié)果如下。
　　1抗畜禽支原體中藥復方肺康明確立
　　采用水回流提取法和微量液體稀釋法，對兩面針、廣藿香、南板藍根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮、艾葉等10味中藥進行體外抗畜禽支原體研究

3、。結(jié)果表明10味中藥中，除了廣藿香、土槿皮和艾葉外，其余7味中藥對3種畜禽支原體均具有不同程度的體外抑制和殺滅作用；對照藥物酒石酸泰樂菌素對試驗用3種畜禽支原體均具有較高的敏感性。對有效的抗畜禽支原體單味中藥進行兩兩聯(lián)合藥物敏感性試驗，結(jié)果表明7味中藥水提液兩兩配伍組合，對牛支原體、雞毒支原體和羊肺炎支原體的抑制效果表明兩面針、南板藍根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮間均無拮抗作用，宜配伍。在中醫(yī)理論的指導下，根據(jù)中醫(yī)方劑組成原則及配伍

4、規(guī)律，自擬7組中藥復方，通過藥敏試驗研究表明原復方和7組中藥復方均具有不同程度的抗畜禽支原體活性，其中復方5（南板藍根、兩面針、白鮮皮）作用最好，且藥味較少，故選用復方5作為抗畜禽支原體最佳中藥復方，命名為肺康明。
　　2中藥復方肺康明藥效學研究
　　對健康雛雞進行臨床用藥安全性研究，結(jié)果表明中藥復方肺康明以16 g生藥/d兌水飲用5 d，雞只內(nèi)臟各器官無任何異常，提示該方此劑量對雞安全。采用1×109 CCU/mL的MG培

5、養(yǎng)物通過雞胸氣囊接種0.5 mL、滴鼻0.3 mL、點眼0.2 mL，以及創(chuàng)造應激條件建立人工感染雞毒支原體雞只模型，并通過臨床癥狀、病理觀察、分離培養(yǎng)、鑒定及血清學診斷，證實了該疾病模型建立成功。臨床藥效試驗結(jié)果表明肺康明高、中劑量組治療 MG人工感染病雞療效顯著。死亡率方面，與感染對照組比較，各用藥組均有不同程度的下降；肺康明高、中劑量和酒石酸泰樂菌素組死亡率均為0％，肺康明低劑量組和預防組死亡率很低，分別為5.00%、2.50%。

6、治愈率方面，肺康明高劑量組療效最好（92.5%），明顯優(yōu)于低劑量組，中劑量組與對照藥物酒石酸泰樂菌素組具有相同的療效（90%）；增重方面，各用藥組均顯著高于感染對照組，但低于正常對照組，而肺康明高劑量組與正常對照組相當；料肉比方面，酒石酸泰樂菌素組最低，其他各用藥組與健康組相當，感染對照組最高；血清抗體水平方面，各用藥組均能明顯減少抗體陽性反應數(shù)，其中肺康明高劑量組效果最佳；氣囊損傷方面，各用藥組氣囊病變較感染對照組輕，其中肺康明高劑量

7、組效果最好，其次為復方肺康明中劑量組和酒石酸泰樂菌素組。提示本復方對 MG感染具有良好的治療效果，并克服抗生素類藥物長期使用會產(chǎn)生耐藥性的缺點，可用于本病的防治。推薦肺康明用于MG雞只的治療量為0.4%兌水飲用給藥濃度，預防量為0.2%兌水飲用給藥濃度，連續(xù)用藥5 d，每天配換一次藥液。
　　3中藥復方肺康明顆粒劑制備工藝研究
　　根據(jù)臨床需要、預試驗結(jié)果、生產(chǎn)條件及技術(shù)水平，選擇劑型為顆粒劑。本試驗主要以多成分多指標綜合評

8、價，采用正交試驗設計和單因素考察法進行最佳制備工藝篩選，最終確定中藥復方肺康明顆粒劑的制備工藝為：取處方比例南板藍根、兩面針、白鮮皮粗粉（10目），精密稱定，加入12倍量的水，浸泡0.5 h，回流提取3次，每次1.5 h，合并3次提取液，超速離心（8000 r/min，15 min）后，真空減壓（溫度60℃，真空度0.08～0.10 MPa，蒸汽壓力≤0.10 MPa）濃縮至相對密度為1.10（60℃）的流浸膏；取該流浸膏進行噴霧干燥，

9、物料溫度：50～60℃，進液速度：50～60 mL/min，進風溫度：165～170℃，出風溫度：70～75℃，收集干燥浸膏粉，按干浸膏粉：糊精=1：0.6混勻，過80目篩，采用干式制粒法，設定軋輥壓力為60～70 kgf/cm2，軋輥轉(zhuǎn)速為12～14 r/min，送粉速度為14～16 r/min制成顆粒1200 g，過篩，分裝，即得。同時經(jīng)三批中試試制證明，擬定工藝簡單合理、穩(wěn)定可行，可滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。
　　4中藥復方肺

10、康明顆粒劑質(zhì)量標準及初步穩(wěn)定性研究
　　質(zhì)量標準研究方面，主要進行原料藥材及輔料質(zhì)量標準和顆粒劑質(zhì)量標準研究。原料藥材及輔料質(zhì)量標準中主要對投料藥材飲片按照《中華人民共和國藥典》2010年版（一部）相關項下規(guī)定進行檢查；輔料—糊精按照《中華人民共和國藥典》2010年版（二部）相關項下規(guī)定進行檢查。顆粒劑質(zhì)量標準中對中試生產(chǎn)的三批樣品進行鑒別、檢查和含量測定研究。對方中各味藥均進行了薄層色譜鑒別試驗，并將南板藍根、兩面針、白鮮皮的薄

11、層色譜鑒別列入本品質(zhì)量標準正文。檢查項下，對粒度、水分、溶化性、裝量差異、重金屬、砷鹽、微生物限度等進行檢查均符合《中國藥典》2010年版一部附錄制劑通則ⅠC顆粒劑項下有關規(guī)定，并將其列入本品質(zhì)量標準正文。采用高效液相色譜法對主要有效成分靛藍、氯化兩面針堿和白鮮堿進行含量測定，并進行了系統(tǒng)方法學考察，均符合要求，并將含量測定列入本品質(zhì)量標準正文，根據(jù)多批樣品測定結(jié)果，制定了主要有效成分的含量限度，暫定本品每袋（5.0 g）含南板藍根以靛

12、藍計，不得低于773.08μg；兩面針以氯化兩面針堿計，不得低于846.84μg；白鮮皮以白鮮堿計，不得低于3301.67μg。初步穩(wěn)定性研究方面，加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明樣品采用鋁塑復合膜袋為包裝材料在考察期內(nèi)其性狀、鑒別、檢查等各項考察指標均符合本品質(zhì)量標準草案規(guī)定，提示本品在高溫高濕條件下貯存6個月，可保證質(zhì)量穩(wěn)定。長期穩(wěn)定試驗結(jié)果表明9個月的考察期內(nèi)其性狀、鑒別、檢查等各項考察指標均符合本品質(zhì)量標準的規(guī)定，提示本品在常溫條件下保存

13、9個月，可保證質(zhì)量穩(wěn)定；試驗結(jié)束時間為24月末，其后續(xù)工作仍在進行當中。
　　5中藥復方肺康明化學成分研究
　　按處方量的200倍稱取南板藍根、兩面針、白鮮皮粗粉，以水回流提取，提取液經(jīng)減壓濃縮和噴霧干燥后，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行部位分離后，采用反復硅膠柱色譜及重結(jié)晶等方法進行系統(tǒng)的化學成分分離與純化，并根據(jù)理化常數(shù)測定和光譜測定（EI-MS或 EIS-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept等）所得數(shù)據(jù)以及文

14、獻對照確定了21單體化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：氯化兩面針堿（nitidine chloride，1），大黃酚（chrysophanic acid，2），熊果酸（ursolic acid，3），靛藍（indigotin，4），靛玉紅（indirubin，5），硬脂酸（stearic acid，6），辛夷脂素（fargesin，7），補骨脂內(nèi)酯（psoralen，8），木犀草素（luteolin，9），香草醛（vanillin，10），棕櫚酸（

15、palmitic acid，11），大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucopyranoside，12），槲皮苷（quercetin-3-rhamnoside，13），梣酮（fraxinellone，14），黃柏酮（obacunone，15），檸檬酸（citric acid，16），白屈菜堿（chelidonine，17），腺苷（adenosine，18），胞苷（cytidine，20），黃芩苷（b

16、aicah，20），苯甲酸（benzoic acid，21）。其中化合物3、7、10～13、16～17、19～21均首次在組成肺康明的3味中藥南板藍根、兩面針和白鮮皮中發(fā)現(xiàn)。綜上所述，本課題通過體外抑菌試驗對10味中藥進行篩選，確定了最佳中藥復方，命名肺康明，對 MG感染具有良好的治療效果，使用安全。對該方進行顆粒劑制備工藝研究，其工藝簡單合理、穩(wěn)定可行，可滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。其制劑基本穩(wěn)定，安全性高，質(zhì)量標準穩(wěn)定、可控。同時從該方