小鼠胚胎腭突細(xì)胞的培養(yǎng)和初級纖毛的觀察.pdf

1、目的：通過對小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，建立穩(wěn)定良好的小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法；分離、培養(yǎng)小鼠胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞，觀察其初級纖毛的情況，為后續(xù)小鼠胚胎腭突發(fā)育期間關(guān)鍵信號因子通過初級纖毛傳遞的實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：體式顯微鏡下剪取GD13.5的小鼠胚胎腭板，經(jīng)0.4％DispaseII酶消化過夜后，機械分離上皮組織和間充質(zhì)組織。①將上皮組織用0.05%胰蛋白酶消化，選擇含5%FBS和5ng/mlEGF的M

2、edium171培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及其生長情況，運用 P-CK和 Vim免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞類型進行鑒定；②將間充質(zhì)組織用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA混合液消化，加入含有10%FBS的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)及傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)及其生長情況，采用P-CK和Vim免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞類型進行鑒定，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測間充質(zhì)細(xì)胞αα-tubulin和γ-tubulin的表達，觀察其初級纖毛的

3、情況。
　　結(jié)果：應(yīng)用DispaseII酶和胰酶雙重消化法，結(jié)合機械分離可以獲取純度較高的小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。鏡下觀察：①上皮細(xì)胞彼此緊密相連成片后呈典型的鋪路石樣，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示上皮細(xì)胞P-CK表達陽性；②間充質(zhì)細(xì)胞呈梭形或多角形散在生長，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示間充質(zhì)細(xì)胞 Vim表達陽性，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測間充質(zhì)細(xì)胞中αα-tubulin呈紅色熒光、γ-tubulin呈綠色熒光，應(yīng)用熒光顯微鏡成功觀察