基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序與植物代謝組學(xué)技術(shù)研究遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑.pdf

1、選題依據(jù):遠(yuǎn)志皂苷作為遠(yuǎn)志藥材中潛在的活性物質(zhì),已被證實(shí)具有益智安神、鎮(zhèn)靜祛痰及抗衰老等多種藥理活性,是遠(yuǎn)志中重要的次生代謝產(chǎn)物。目前,對遠(yuǎn)志皂苷的研究多集中于化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定、化合物分離和藥理活性等方面,對遠(yuǎn)志分子生物學(xué)的研究較少,而有關(guān)遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑研究更是缺乏,目前,主要存在以下兩個(gè)問題:(1).遠(yuǎn)志功能基因數(shù)據(jù)庫缺乏,NCBI數(shù)據(jù)庫中關(guān)于遠(yuǎn)志的mRNA僅5條(截止2014.02),與人參、丹參、三七等大量基因資源相比較,不能滿

2、足后續(xù)對遠(yuǎn)志次生代謝產(chǎn)物生物合成通路的基礎(chǔ)研究。(2).遠(yuǎn)志皂苷作為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類化合物的一種,從乙酰輔酶 A到角鯊烯這個(gè)上游代謝途徑比較清晰,其從角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)到最后三萜皂苷形成的下游代謝通路每個(gè)物種都有各自的規(guī)律,而有關(guān)遠(yuǎn)志皂苷的代謝途徑及關(guān)鍵酶基因尚不清晰,無法為遠(yuǎn)志皂苷含量的提高提供理論基礎(chǔ);因此,本論文對這些問題進(jìn)行探究,以期能完善遠(yuǎn)志酶基因數(shù)據(jù)庫,并更好了解遠(yuǎn)志皂苷合成途徑,從而為其在遠(yuǎn)志中的基因調(diào)控和遺

3、傳轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。
　　目的:1.基于高通量測序技術(shù)進(jìn)行遠(yuǎn)志轉(zhuǎn)錄組研究,豐富遠(yuǎn)志的基因資源。2.基于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫,篩選出遠(yuǎn)志合適的內(nèi)參基因,為熒光定量 PCR技術(shù)(qRT-PCR)技術(shù)在遠(yuǎn)志基因差異表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。3.通過植物代謝組學(xué)技術(shù)和 qRT-PCR技術(shù)結(jié)合,結(jié)合遠(yuǎn)志三萜皂苷峰強(qiáng)度與遠(yuǎn)志皂苷合成途徑中酶基因表達(dá)高低的相關(guān)性,找到在遠(yuǎn)志不同部位遠(yuǎn)志皂苷合成途徑中差異表達(dá)的功能基因,為今后通過生物工程調(diào)控遠(yuǎn)志皂苷含量奠定基礎(chǔ)。

4、
　　方法:1.應(yīng)用 Illumina高通量測序技術(shù)對遠(yuǎn)志根組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并通過生物信息學(xué)分析,獲得大量遠(yuǎn)志基因信息。
　　2.采用實(shí)驗(yàn)室前期建立的超高效液相色譜(UPLC)分析方法對不同部位、不同年限及不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志進(jìn)行UPLC圖譜分析,初步分析皂苷含量差異,篩選下一步研究對象。
　　3.基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF MS)代謝組學(xué)技術(shù),對遠(yuǎn)志不同部位進(jìn)行代謝組學(xué)研

5、究,指認(rèn)并分析了遠(yuǎn)志皂苷類化合物在不同部位的含量差異。
　　4.采用qRT-PCR技術(shù),基于先前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,篩選遠(yuǎn)志內(nèi)參基因,并采用2-ΔΔCT法對涉及遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑的15種基因在遠(yuǎn)志不同部位表達(dá)水平進(jìn)行分析;結(jié)合皂苷合成途徑中酶基因表達(dá)與UPLC/Q-TOF MS分析皂苷峰強(qiáng)度的相關(guān)性來闡述造成不同部位間遠(yuǎn)志次生代謝差異的分子機(jī)理。
　　結(jié)果:1.本研究對遠(yuǎn)志的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和組裝統(tǒng)計(jì),結(jié)果得到11547

6、7條Unigenes,總長149 Mb;通過分別與NCBI的Nt、Nr、Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫、COG數(shù)據(jù)庫及 KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,對Unigenes進(jìn)行了功能比對和注釋。
　　2.基于UPLC技術(shù)對遠(yuǎn)志不同年限、部位和產(chǎn)地進(jìn)行篩選,研究結(jié)果表明,遠(yuǎn)志不同部位318nm波長下的UPLC指紋圖譜的相似度明顯小于不同產(chǎn)地和不同年限,且通過文獻(xiàn)比對初步指認(rèn)結(jié)果,篩選出遠(yuǎn)志不同部位的遠(yuǎn)志皂苷含量差異最大。
　　3.通過

7、UPLC/Q-TOF MS化合物指認(rèn),共鑒定出25個(gè)化合物,其中包括4個(gè)遠(yuǎn)志口山酮類化合物,6個(gè)蔗糖酯類化合物,8個(gè)寡糖酯類化合物及7個(gè)三萜皂苷類化合物,通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志不同部位的22個(gè)代謝差異物,除Lancerin和7-O-Methylmangiferin外,其他化合物均在根中含量最高,且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)莖、葉和種子中的7個(gè)三萜皂苷類化合物與根比較均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　4.基于先前遠(yuǎn)志轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,采用q

8、RT-PCR技術(shù),篩選了18s RNA,UBC2,ACT11,GAPDH,TUA,ACT1和EF1a等常用的7個(gè)內(nèi)參基因,根據(jù)GeNorm軟件和NormFinder軟件計(jì)算結(jié)果,發(fā)現(xiàn)GAPDH基因在遠(yuǎn)志不同部位中最為穩(wěn)定;以GAPDH作為遠(yuǎn)志內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法對遠(yuǎn)志皂苷生物合成途徑涉及的15種基因在遠(yuǎn)志不同部位表達(dá)水平進(jìn)行了分析,通過遠(yuǎn)志三萜皂苷峰強(qiáng)度與遠(yuǎn)志皂苷合成途徑中酶基因表達(dá)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)三萜皂苷骨架合成途徑中,鯊烯合成

9、酶(Squalene synthase,SQS)、鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase,SQE))和β-香樹脂合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)與各組織三萜皂苷中分布相關(guān)性最大,對比推測的6個(gè)CYP450和UGT酶在不同組織中的表達(dá)情況,與三萜皂苷在不同組織的分布相關(guān)性不明顯。
　　結(jié)論:本研究對遠(yuǎn)志轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了組裝統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析,獲得大量遠(yuǎn)志基因信息,基于遠(yuǎn)志轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出GAP