長春花轉(zhuǎn)錄組與萜類吲哚生物堿代謝途徑研究.pdf

1、長春花是抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿的唯一植物來源，也是研究萜類吲哚生物堿(TIA)生物合成與調(diào)控的模式物種。本研究分別利用Illumina二代測序技術(shù)和PacBio三代測序技術(shù)對長春花的葉、花和根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序和分析。通過Illumina測序共得到140，787，121條短reads，經(jīng)de novo拼接獲得191，167條unigenes，平均長度674bp?；蜃⑨尠l(fā)現(xiàn)了許多參與不同生物學(xué)過程和具有不同功能的基因，56.12％的

2、基因在與7大數(shù)據(jù)庫的比對中顯示出同源性。GO分類鑒定出261個(gè)與次生代謝有關(guān)的基因，KOG分類鑒定出1809個(gè)與次生代謝合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解有關(guān)的基因，KEGG注釋鑒定出604個(gè)與萜類合成有關(guān)的基因及12個(gè)與吲哚生物堿合成有關(guān)的基因。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，大多數(shù)TIAs途徑相關(guān)基因在根和葉中的表達(dá)量較高，而文多靈途徑的特有基因則在地上部分具有較高的表達(dá)量。因此，根據(jù)與已知基因的共表達(dá)原理，篩選出可能參與TIAs生物合成的8個(gè)P450候選基因

3、和5個(gè)功能基因。三代測序共獲得786，008條長reads，其中花264，553條、根262，140條、葉259，315條。經(jīng)數(shù)據(jù)處理，得到全長轉(zhuǎn)錄本（full-length reads）378，581條（花:123，665條、根:120，510條、葉:134，406條），非全長轉(zhuǎn)錄本（non-full-length reads）311，081條（花:105，613條、根:106，459條、葉:99，009條）。通過比對全長轉(zhuǎn)錄本序列，

4、分析轉(zhuǎn)錄因子及已知的長春花TIAs途徑催化酶編碼基因，發(fā)現(xiàn)了一些可能的可變剪切形式，提示可變剪切可能參與TIAs生物合成途徑的調(diào)控。采用不同平臺進(jìn)行的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)檠芯块L春花特殊的次生代謝產(chǎn)物合成途徑提供了豐富的數(shù)據(jù)資源，PacBio三代測序技術(shù)在讀長上的優(yōu)勢也使得分析可變剪切及探究可變剪切對TIAs途徑相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響成為了可能。
　　本研究還初步探索了通過在釀酒母中重構(gòu)TIAs合成途徑生產(chǎn)TIAs的可行性。首先通過轉(zhuǎn)

5、錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母稀有密碼子在長春花基因中的使用頻率偏低，推測長春花基因適合在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)?？寺×?0個(gè)已知的環(huán)烯醚萜途徑催化酶基因，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，除CPR、DLGT、IRS和LAMT存在個(gè)別堿基的差異外，其余序列均與GenBank序列完全一致。采用SOE-PCR法構(gòu)建催化環(huán)烯醚萜途徑前兩步反應(yīng)的GES、G10H和CPR表達(dá)模塊，通過酵母體內(nèi)重組方法構(gòu)建三元表達(dá)載體，建立從元件選擇、模塊構(gòu)建到多模塊體內(nèi)重組的技術(shù)流程，為實(shí)