長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿合成途徑重要基因及轉(zhuǎn)錄因子功能研究.pdf

1、長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus L.G.Don)萜類吲哚生物堿(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)的生物合成途徑是一個(gè)由眾多生化反應(yīng)步驟構(gòu)成的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)，受到嚴(yán)格調(diào)控。目前已經(jīng)克隆的長(zhǎng)春花TIAs合成途徑相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)量超過(guò)了三十個(gè)，有關(guān)的酶和基因研究工作也開(kāi)展了多年，TIAs合成途徑的大體路徑基本清晰，但是現(xiàn)在對(duì)于調(diào)控TIAs合成的關(guān)鍵酶仍然不清楚。迄今為止，還沒(méi)有一個(gè)在相同的

2、實(shí)驗(yàn)條件下所做的基因表達(dá)的專門比較實(shí)驗(yàn)報(bào)道。針對(duì)這種狀況，本研究首次開(kāi)展了在相同實(shí)驗(yàn)條件下的基因表達(dá)比較的實(shí)驗(yàn)工作。我們以生長(zhǎng)旺盛的觀賞兼藥用植物長(zhǎng)春花無(wú)菌苗為遺傳轉(zhuǎn)化材料，選擇長(zhǎng)春花吲哚生物堿(TIAs)生物合成途徑上六個(gè)重要酶(DXR，G10H，STR，TDC，DAT，PRX1)為研究對(duì)象，根據(jù)它們的已知基因序列分別構(gòu)建了六個(gè)單轉(zhuǎn)植物表達(dá)載體(pCAMBIA1304++gene)；另外，還選擇與TIAs合成有關(guān)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(ORC

3、A2，ORCA3)，根據(jù)其基因序列分別構(gòu)建了兩個(gè)單轉(zhuǎn)植物表達(dá)載體(pCAMBIA1304++gene)和一個(gè)共轉(zhuǎn)植物表達(dá)載體(pCAMBIA1304％ Orca2+Orca3)，以發(fā)根農(nóng)桿菌C58CI為介導(dǎo)，通過(guò)這八個(gè)基因的單獨(dú)轉(zhuǎn)化和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的共轉(zhuǎn)化，分別得到了大量單/共轉(zhuǎn)基因毛狀根系。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因毛狀根系的抗性篩選、毛狀根樣品的分子生物學(xué)檢測(cè)與驗(yàn)證、用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)基因毛狀根中基因的相對(duì)表達(dá)水平、以及用

4、高效液相色譜(HPLC)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因毛狀根中長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的含量，分別得到了檢測(cè)結(jié)果。
　　 通過(guò)檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，能夠驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與否，從而篩選出轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性樣品做為檢測(cè)TIAs含量的材料；同時(shí)分析單轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子基因毛狀根中結(jié)構(gòu)基因的相對(duì)表達(dá)量，判斷哪些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，從而尋找轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控靶基因。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化毛狀根中TIAs的含量變化，能夠確定究竟那些酶才是真正調(diào)控TIAs合成的關(guān)鍵酶，進(jìn)而為指

5、導(dǎo)長(zhǎng)春花次生代謝工程研究提供理論依據(jù)。因此，本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖牵?）篩選長(zhǎng)春花細(xì)胞中控制TIAs生物合成的關(guān)鍵酶；2）尋找重要轉(zhuǎn)錄因子的新的調(diào)控靶基因。本研究得到以下結(jié)果：
　　 1.DXR、STR分別是TIAs合成途徑上、中游的關(guān)鍵酶。通過(guò)HPLC方法檢測(cè)六個(gè)單轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)基因和兩個(gè)單轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子基因，以及一個(gè)共轉(zhuǎn)的毛狀根樣品中長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈含量，結(jié)果證明：與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(即C58CI，平均含量為2.77±0.652 mg/g DW)

6、相比較，六個(gè)轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的長(zhǎng)春質(zhì)堿含量都有提高，其中單轉(zhuǎn)Str基因毛狀根中長(zhǎng)春質(zhì)堿平均含量最高(6.579±0.711 mg/g DW)，單轉(zhuǎn)Tdc基因和Dat基因毛狀根中長(zhǎng)春質(zhì)堿平均含量為最低（平均含量分別為3.177±0.623 mg/g DW、3.488±0.696 mg/g DW,）。文多靈含量的檢測(cè)結(jié)果是：?jiǎn)无D(zhuǎn)Dxr基因和Prxl基因毛狀根中的文多靈平均含量高于其它4種單轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品，而單轉(zhuǎn)Dat基因和Tdc基因的毛狀

7、根中文多靈平均含量較低(平均含量分別為0.0414-0.0073 mg/g DW、0.044±0.0091 mg/g DW,)，幾乎與實(shí)驗(yàn)對(duì)照C58C1(平均含量為0.0375±0.007 mg/g DW)相同。因此，就合成長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈而言，DXR、STR分別是TIAs合成途徑上、中游的關(guān)鍵酶，而G10H并沒(méi)有學(xué)術(shù)界所預(yù)期的那么重要，我們推論GIOH可能在一定的條件下才具有重要作用。
　　 2.PRX1是TIAs合成途徑下游

8、的一個(gè)關(guān)鍵酶。用FQ--PCR方法檢測(cè)單轉(zhuǎn)Orca3基因的毛狀根樣品，在所有檢測(cè)的各個(gè)基因中，Prxl基因的表達(dá)量最高，相對(duì)表達(dá)量平均達(dá)到12.18±1.442，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它基因的表達(dá)量，如此高的Prxl基因表達(dá)量，說(shuō)明ORCA3能夠通過(guò)調(diào)控Prxl基因表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控TIAs合成途徑下游的合成速度。另一方面，HPLC檢測(cè)結(jié)果證明，單轉(zhuǎn)Prxl基因毛狀根樣品中的長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈含量都有明顯高于對(duì)照組樣品，尤其是文多靈的含量在六種轉(zhuǎn)基因

9、毛狀根樣品中達(dá)到最大，為0.1043±0.017 mg/g DW。因此，我們認(rèn)為PRX1是TIAs合成途徑下游的一個(gè)關(guān)鍵酶。
　　 3.G10h很可能是ORCA2的調(diào)控靶基因。用PO-PCR方法檢測(cè)8個(gè)Orca2轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的相對(duì)基因表達(dá)量，都得到了幾乎一致的檢測(cè)數(shù)據(jù)，平均相對(duì)表達(dá)量為1.642±0.288（即GlOh基因的表達(dá)量比實(shí)驗(yàn)對(duì)照高出1.64倍）。而在檢測(cè)的8個(gè)0rca3轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品中，GlOh的平均相對(duì)表達(dá)量

10、僅為0.57士0.093。從檢測(cè)的結(jié)果分析，在0rca2和0rca3轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品的相對(duì)表達(dá)量都不高。
　　 4.Lamt和S1s基因的表達(dá)受到0RCA2和ORCA3的共同調(diào)控。經(jīng)過(guò)P-PCR方法檢測(cè)，結(jié)果表明Lamt基因在單轉(zhuǎn)Orca單轉(zhuǎn)Orca3因毛狀根樣品中的相對(duì)表達(dá)量平均分別為2.8±0.634和7.437±0.632，而S1s基因在這兩種樣品中的相對(duì)表達(dá)量平均分別是3.55士0.76和3.265士1.06。這說(shuō)明La

11、mt和S1s基因的表達(dá)量明顯受到ORCA2和ORCA3的共同調(diào)控。
　　 5.Hmgr表達(dá)受到ORCA3調(diào)控。FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果為：Hmg在Orca2 Orca3轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.37±0.42和6.64±1.21。這表明Hmgz的表達(dá)強(qiáng)烈受到轉(zhuǎn)錄因子ORCA3調(diào)控。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，ORCA3轉(zhuǎn)錄因子既能調(diào)控TIAs合成途徑上游的MEP途徑，保證TIAs的正常合成；同時(shí)，還通過(guò)調(diào)控Hgr基因的表達(dá)而簡(jiǎn)單