長春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)TK基因突變的比較研究及兩類突變集落機(jī)制研究.pdf

1、非整倍體是人類健康中非常嚴(yán)重的遺傳問題，因此非整倍體誘變劑的檢測是非常重要。目前國內(nèi)外尚未見用人類淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)評(píng)價(jià)紡錘體毒物遺傳毒性的報(bào)道，本研究使用人類淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)，對(duì)非整倍體毒物的檢出能力以及P53蛋白對(duì)該試驗(yàn)體系檢出率的影響做一探討，同時(shí)對(duì)正常生長和緩慢生長突變集落產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行研究。 本課題分為以下三部分： 第一部分：長春花堿3小時(shí)和24小時(shí)處理TK6細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)比

2、較研究。目的是比較長春花堿不同處理時(shí)間對(duì)TK6細(xì)胞的誘變性。結(jié)果表明長春花堿3h處理TK6細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)，其突變頻率與對(duì)照組相比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而24h處理結(jié)果顯示其有明顯的誘變 性，表明長時(shí)間處理對(duì)于紡錘體毒物等細(xì)胞周期依賴的誘變劑可能是必要的。 第二部分：長春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)TK6和TK6-E6細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)比較研究。目的比較用人淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)對(duì)紡錘體毒物的檢出能力以及P53蛋白對(duì)該體系

3、檢測能力的影響。結(jié)果顯示隨受試物濃度的增加細(xì)胞毒性指標(biāo)RS、RV、RSG和RTG值均而下降，表 明長春花堿和秋水酰胺對(duì)TK6和TK6-E6細(xì)胞的毒性隨著濃度的增加而增大。相同劑量下，TK6-E6細(xì)胞的RS％和RSG％均比TK6高，提示TK6細(xì)胞對(duì)受試物的細(xì)胞毒性更敏感。隨著長春花堿和秋水酰胺濃度的增加，除CCM處理的TK6-E6組外，TK6細(xì)胞和TK6-E6細(xì)胞的突變頻率逐漸上升，各劑量組與陰性對(duì)照相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且除了MF中

4、CCM5.0ng/ml組，其它相同劑量下，TK6的MF均低于TK6-E6細(xì)胞(p<0.05)。由于TK6-E6細(xì)胞的RS、RSG、RTG和MF均較TK6細(xì)胞高，接種平板總細(xì)胞數(shù)少于TK6細(xì)胞，且TK6-E6的群體倍增時(shí)間短于TK6細(xì)胞，故建議優(yōu)先用TK6-E6細(xì)胞。 第三部分：兩種類型的突變集落的比較：目的是研究兩類集落的形成機(jī)理。本部分采用 tk 基因雜合性丟失分析、微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性丟失分析和G帶核型分析，從分子水平和染色體

5、水平研究長春花堿誘導(dǎo)的TK6 和TK6-E6細(xì)胞二類集落的不同。 1．正常生長集落和緩慢生長集落表比較：結(jié)果顯示緩慢生長的突變集落平均生長速度慢于正常生長的突變集落的；TK6-E6的SC生長速度快于TK6細(xì)胞的SC的速度。長春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)的TK6和TK6-E6細(xì)胞突變體中，SC在TK6-E6細(xì)胞中占主要比例。相同劑量下，TK6-E6的SC％高于TK6細(xì)胞的。兩類細(xì)胞中，SC％與劑量之間無劑量-依賴關(guān)系。 2．正

6、常生長和緩慢生長突變集落tk基因位點(diǎn)雜合性丟失研究：本試驗(yàn)通過對(duì)TK6和TK6-E6細(xì)胞自發(fā)和VBL誘發(fā)的突變集落進(jìn)行tk基因TKexon7雜合性丟失分析，結(jié)果表明不論自發(fā)或誘發(fā)的，正常生長或緩慢生長的突變集落中，tk基因位點(diǎn)雜合性丟失都是主要的突變事件。 3．兩類集落17號(hào)染色體STR位點(diǎn)雜合性丟失情況分析：采用17號(hào)染色體長臂上的5個(gè)STR位點(diǎn)(D17S932、D17S807、D17S785、D17S784、D17S928

7、)研究了TK6和TK6-E6細(xì)胞自發(fā)突變和VBL誘發(fā)的突變集落中染色體損傷范圍，兩種細(xì)胞正常生長比緩慢生長的突變集落染色體損傷范圍小。長春花堿除了誘導(dǎo)TK6和TK6-E6細(xì)胞整條染色體丟失外，還可導(dǎo)致部分染色體損傷。 4．采用G顯帶技術(shù)分析了正常TK6和TK6-E6細(xì)胞核型以及長春花堿誘導(dǎo)的TK6和TK6-E6細(xì)胞突變集落中染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常，探討正常生長和緩慢生長集落與他們遺傳特征關(guān)系。結(jié)果表明TK6細(xì)胞的正常核型為47，X

8、Y,+13，14q+?，21p+?，TK6-E6細(xì)胞的為47，XY,+13p+?14q+?，21p+?。兩類集落中自發(fā)和誘發(fā)、正常和緩慢生長的突變細(xì)胞之間，17號(hào)染色體異常的比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從趨勢來講，兩類細(xì)胞中VBL誘發(fā)的突變集落中17號(hào)染色體異常比例高于自發(fā)突變的集落，緩慢生長的集落染色體異常比例高于正常生長細(xì)胞的，提示增大樣本量，二者可能有差異。 總結(jié)： 1．長時(shí)間處理對(duì)于紡錘體毒物等細(xì)胞周期依賴的誘變劑是