環(huán)境脅迫對(duì)長春花TIAs生物合成的調(diào)控及相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、生物堿（Alkaloids）是植物天然次生代謝產(chǎn)物中數(shù)量最多的一類含氮堿性化合物。許多生物堿由于具有特殊的藥理學(xué)活性已引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。長春花(Catharanthusroseus)中含有長春堿(Vinblastine，VBL)、長春新堿(Vincristine，VCR)等重要的抗腫瘤萜類吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids，TIAs），成為近年來生物制藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并被確定為研究植物次生代謝的模式植物

2、。
　　長春花為喜光性植物，性喜高溫高濕，耐半陰。近年來，不少學(xué)者從改變長春花的環(huán)境因素方向進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)長春花植株體中吲哚生物堿的積累量的高低和環(huán)境因子有關(guān)。光和干旱脅迫等環(huán)境因子改變TIA生物合成和積累過程中的代謝流向，但從生物堿合成的環(huán)境調(diào)控機(jī)理和相關(guān)因表達(dá)影響方面研究比較少，本文一方面利用紅色遮光膜遮蔭的方法，對(duì)長春花的無菌苗進(jìn)行處理，檢測葉片中色素含量和生物堿含量變化以及生物堿合成相關(guān)基因的表達(dá)，探討葉綠素含量變化和相關(guān)

3、基因表達(dá)與生物堿積累的關(guān)系。采用同樣的紅膜遮蓋處理長春花實(shí)生苗，對(duì)葉片色素含量和生物堿合成相關(guān)基因表達(dá)的分析，以及生物堿含量測定，綜合兩種處理，闡明光質(zhì)和光強(qiáng)對(duì)長春花生物堿積累的調(diào)控機(jī)理;另一方面，運(yùn)用植物生理生態(tài)學(xué)理論和方法，研究長春花在6種不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫下的脯氨酸含量和葉片相對(duì)含水量的變化情況，進(jìn)而在優(yōu)化PEG6000模擬干旱脅迫下，研究葉片POD活性、生物堿含量和相關(guān)基因的表達(dá)，并且分析與細(xì)胞壁降解相關(guān)的果膠甲

4、基酯酶(Pectin methylesterase，PME)的基因的表達(dá)變化，探討滲透脅迫對(duì)生物堿合成的調(diào)控機(jī)理。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　(1)通過HPLC方法測定紅膜處理長春花無菌苗和對(duì)照葉片中生物堿含量，文多靈(Vindoline，VIN)和長春質(zhì)堿（Catharanthine，CAT）的含量緩慢上升后逐漸下降，并且低于對(duì)照;耦合VIN和CAT的產(chǎn)物VBL含量均逐漸高于對(duì)照，在處理第15天達(dá)到最高，通過SQ-RT-

5、PCR測定長春花生物堿代謝途徑中5個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，通過Quantify One軟件數(shù)量化電泳結(jié)果，數(shù)據(jù)分析表明低光環(huán)境對(duì)G10h基因表達(dá)影響不明顯，相關(guān)性分析得出D4h和Dat基因表達(dá)水平較好的反映TIA合成路徑的文多靈的積累，Tdc和Str基因表達(dá)水平較好的反映長春質(zhì)堿積累，調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生。因此在研究工作中，通過分析關(guān)鍵基因的表達(dá)水平快速準(zhǔn)確地推測長春花中對(duì)應(yīng)生物堿的含量。
　　(2)相同的紅色濾光膜遮光處理長春花實(shí)

6、生苗，綜合分析兩種處理低光環(huán)境下的光質(zhì)和光強(qiáng)，透過膜的光強(qiáng)下降幅度基本相同。在一定時(shí)間Tdc， Str，D4h和Dat基因表達(dá)與對(duì)應(yīng)的VIN和CAT的含量有相關(guān)性。紅膜誘導(dǎo)的低光環(huán)境，一定時(shí)間有利于VIN和CAT含量合成和積累。對(duì)比兩種環(huán)境下色素含量:類胡蘿卜素含量和葉綠素含量變化明顯不同，推測調(diào)節(jié)長春花體內(nèi)激素含量變化，因而影響長春堿的生物合成。
　　(3)通過6種不同濃度PEG6000脅迫處理長春花，通過茚三酮比色法測定脯氨酸

7、含量，測定葉片相對(duì)含水量，結(jié)果表明:相同濃度PEG6000處理下，隨著脅迫時(shí)間的延長，葉片相對(duì)含水量下降——上升的趨勢和脯氨酸含量緩升——急升的趨勢。相同時(shí)間下，隨著PEG濃度增強(qiáng)，葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量變化的差異越顯著，綜合二因素的差異顯著分析，本研究選擇35％PEG6000模擬干旱脅迫處理長春花。
　　(4)35％濃度PEG6000模擬干旱脅迫長春花幼苗，葉片中POD活性逐漸增強(qiáng)，有利于VIN和CAT向VBL的合成。干旱脅

8、迫下，長春花葉片中的文多靈含量和長春質(zhì)堿含量下降，長春堿含量逐漸升高24 h達(dá)到峰值。說明POD受滲透脅迫的影響，活性增強(qiáng)，調(diào)節(jié)單吲哚生物堿向雙吲哚生物堿的轉(zhuǎn)化。在一定時(shí)間Tdc，Str和Dat基因的轉(zhuǎn)錄水平的積累，對(duì)應(yīng)的酶將被激活，進(jìn)一步反映了基因表達(dá)與對(duì)應(yīng)的單吲哚生物堿生物堿之間的相關(guān)性，確定TIAs生物合成和積累代謝瓶頸，對(duì)更好的開發(fā)利用長春花的藥用資源有很大的實(shí)踐意義和理論價(jià)值。
　　(5)細(xì)胞壁是植物細(xì)胞最基本的組成結(jié)構(gòu)