溫經(jīng)通絡(luò)湯對膝骨性關(guān)節(jié)炎IL-18表達(dá)影響的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的:探討IL-18在膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜、軟骨細(xì)胞中的表達(dá)與定位及其在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用與機(jī)制;以及溫經(jīng)通絡(luò)湯通過影響IL-18的表達(dá)水平對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜、軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，并觀察其臨床療效。
　　方法:(1)隨機(jī)選取OA組與對照組膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織，采用HE染色切片觀察兩組軟骨及滑膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)情況;運(yùn)用real-timePCR檢測兩組滑膜、軟骨組織中IL-18 mRNA表達(dá)水平;運(yùn)用western blot

2、檢測兩組滑膜、軟骨組織中IL-18蛋白表達(dá)水平;運(yùn)用免疫組化檢測IL-18在兩組滑膜、軟骨組織中的表達(dá)和分布情況;運(yùn)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，檢測IL-18在OA患者軟骨細(xì)胞及滑膜組織中的T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞以及巨噬樣滑膜細(xì)胞的共定位情況。(2)運(yùn)用Western blot分析OA組與對照組膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨中TNF-α的表達(dá)情況;運(yùn)用免疫熒光以及免疫共沉淀技術(shù)，觀察IL-18與TNF-α在OA患者滑膜及軟骨組織中相互作用情況。

3、(3)應(yīng)用組織原代培養(yǎng)法分別獲取OA組與對照組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，通過細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取第3代軟骨細(xì)胞及第2代滑膜細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白及培養(yǎng)基，首先分別行Western blot和Elisa法對直接提取OA患者軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后其炎癥反應(yīng)維持情況進(jìn)行分析，然后分為含藥組:加10％大鼠溫經(jīng)通絡(luò)湯血清的DMEM培養(yǎng)液;對照組:加10％普通大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液;正常組:不做任何處理。細(xì)胞培養(yǎng)48h后分別行

4、Westem blot和Elisa分析檢測溫經(jīng)通絡(luò)湯對膝骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞IL-18、TNF-α表達(dá)的影響。(4)通過檢測IL-18在膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清、滑液及軟骨中的表達(dá)，探討其在OA患者中的表達(dá)水平與醫(yī)學(xué)影像學(xué)嚴(yán)重程度（Kellgren and Lawrence，KL分級）之間的關(guān)系。33例OA患者（其中KL2級10例，KL3級12例，KL4級11例）作為病例組，15例(KL0級)作為對照組。運(yùn)用Elisa及免疫熒光

5、等方法檢測IL-18在膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清、滑液及軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平與放射學(xué)嚴(yán)重程度(K-L分級)之間的相關(guān)性。(5)根據(jù)Kellgren-Lawrance(K-L)放射線分級標(biāo)準(zhǔn)，臨床應(yīng)用40例，分為4組:對照組（KL0級）10例，輕度組（KL1-2級）10例，中度組（KL3級）10例，重度組（KL4級）10例，均給予服用溫經(jīng)通絡(luò)湯1周，采用Elisa法檢測各組服藥前后血清中IL-18的表達(dá)水平以及膝關(guān)節(jié)臨床癥狀及HSS功能評分情況

6、。
　　結(jié)果:(1) OA組患者軟骨及滑膜組織切片行HE染色，可見軟骨細(xì)胞腫脹，變性壞死，軟骨細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)膠原發(fā)生纖維性變;滑膜組織明顯可見滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)組織纖維化、內(nèi)生血管明顯。OA組滑膜及軟骨的IL-18 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果提示:OA組滑膜及軟骨組織中IL-18陽性細(xì)胞的數(shù)量要明顯要高于對照組(P＜0.05)。免疫熒光結(jié)果提示:OA患者滑膜組織中，IL-18主要表

7、達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及活性成纖維樣滑膜細(xì)胞上。同時，IL-18在OA軟骨細(xì)胞中亦出現(xiàn)廣泛表達(dá)。(2) Western blot分析結(jié)果提示OA患者滑膜及軟骨組織中TNF-α的表達(dá)均明顯高于對照組(P＜0.05)。熒光雙標(biāo)記顯示在OA患者滑膜及軟骨組織中，IL-18和TNF-α均存在共定位。免疫共沉淀結(jié)果表明IL-18與TNF-α在OA滑膜及軟骨組織中加強(qiáng)，而在對照組中則為陰性。表明IL-18和TNF-α在OA患者滑膜及軟骨

8、組織中均存在相互作用。(3)通過用組織原代培養(yǎng)及細(xì)胞傳代培養(yǎng)法成功獲取了OA組與對照組膝關(guān)節(jié)第3代軟骨細(xì)胞及第2代滑膜細(xì)胞。Western blot和Elisa法結(jié)果顯示，經(jīng)傳代培養(yǎng)的OA軟骨及滑膜細(xì)胞中TNF-α、 IL-18蛋白表達(dá)水平明顯較對照組增加(P＜0.05)，表明通過直接提取OA患者軟骨、滑膜細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其炎癥反應(yīng)仍可以維持在較高水平。溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清有下調(diào)軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞中IL-18與TNF-α蛋白表達(dá)水平的作

9、用(P＜0.05)。(4)臨床研究中血清、滑液中IL-18表達(dá)以及關(guān)節(jié)軟骨中IL-18陽性細(xì)胞數(shù)目與OA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P＜0.05)。同時，OA患者血清、關(guān)節(jié)滑液及關(guān)節(jié)軟骨中IL-18的表達(dá)水平之間亦呈正相關(guān)(P＜0.05)。(5)溫經(jīng)通絡(luò)湯可以有效降低膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-18表達(dá)水平，服藥后各組的膝關(guān)節(jié)HSS功能評分明顯提高，臨床癥狀明顯改善，尤其對于輕、中度患者。
　　結(jié)論:(1)膝關(guān)節(jié)OA滑膜及軟骨組織中，IL-