黃芪甲苷抑制載脂蛋白E基因缺陷小鼠心臟重構(gòu)的機(jī)制研究.pdf

1、心臟重構(gòu)是指心臟受到各種內(nèi)外刺激后，心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等出現(xiàn)一系列適應(yīng)性改變，其病理特點(diǎn)主要包括心肌肥厚及間質(zhì)纖維化等，其病理機(jī)制主要涉及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活。心臟重構(gòu)早期為代償性適應(yīng)，晚期失代償可發(fā)展為慢性心衰(congestive heart failure，CHF)，而CHF是全球人群病死率的一個(gè)主要原因。因此，在臨床中，抑制心臟重構(gòu)是治療CHF的重要策略，如β受體阻滯劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗劑等抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)藥

2、物的使用，對(duì)預(yù)防心臟重構(gòu)、治療CHF均取得一定效果。但CHF的發(fā)病率和病死率仍居高不下，因此研究心臟重構(gòu)分子機(jī)制及干預(yù)藥物具有必要性。
　　高膽固醇血癥被認(rèn)為是心血管疾病，尤其是冠心病的主要危險(xiǎn)因素之一，它可增加全因死亡率，其負(fù)面臨床意義已得到反復(fù)證實(shí)。既往研究提示高膽固醇血癥是引起左心室肥厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在心臟重構(gòu)的發(fā)病及進(jìn)展中起重要作用。載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是被廣泛用作研究高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化性等疾

3、病的動(dòng)物模型，ApoE-/-除有血管表型外，還有如心臟質(zhì)量增加、室壁厚度增加、心肌纖維化和心功能減低等心臟表型改變。關(guān)于ApoE-/-小鼠心臟重構(gòu)的機(jī)制以及相關(guān)干預(yù)措施的研究很少。同時(shí)，高膽固醇血癥對(duì)心肌細(xì)胞的再生、老化、凋亡以及P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響也知之甚少。
　　黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，ASTⅣ)是從中藥黃芪中分離出來(lái)的一種羊毛脂醇型四環(huán)三萜天然單體皂苷，具多重抗心血管疾病藥理活性，既往研究證實(shí)ASTⅣ可以

4、抑制病毒感染、缺血缺氧等引起的心臟重構(gòu)，降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕心肌纖維化，抗氧化應(yīng)激等。然而，ASTⅣ對(duì)高膽固醇血癥引起的心臟重構(gòu)的影響及可能機(jī)制的研究尚無(wú)。因此，本研究目的是觀察ASTⅣ干預(yù)ApoE-/-小鼠心臟重構(gòu)的療效及探索其相關(guān)機(jī)制。
　　目的：
　　驗(yàn)證假說(shuō):高膽固醇血癥可引起心肌細(xì)胞增殖能力改變，促進(jìn)心肌細(xì)胞老化、凋亡和心肌纖維化，影響P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活狀態(tài)，最終導(dǎo)致以心肌肥厚、心功能下降為特點(diǎn)的病理性心

5、臟重構(gòu);而ASTⅣ治療能抑制高膽固醇血癥所致的心臟重構(gòu)，進(jìn)而改善心功能。
　　方法：
　　1.AST-Ⅳ準(zhǔn)備
　　ASTⅣ的純度≥98％，羥丙基-β-環(huán)糊精溶解為濃度1％和10％ ASTⅣ溶液。
　　2.動(dòng)物分組
　　雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為高脂模型組(KO，n=14)，低濃度ASTⅣ干預(yù)組(AST-LD，n=7)，高濃度ASTⅣ干預(yù)組(AST-HD，n=8)，以同齡同性別野生型C57BL/6J小鼠(

6、WT，n=15)為對(duì)照組。8周齡時(shí)，分別獲取WT(n=8)和KO(n=7)組小鼠治療前各參數(shù)的基線水平。此后，AST-LD和AST-HD組分別隔日腹腔注射1mg/kg和10 mg/kg的ASTⅣ，余組以同方式同時(shí)長(zhǎng)給予等劑量溶劑，SPF級(jí)普食喂養(yǎng)。藥物干預(yù)8周（即小鼠16周齡），心臟超聲檢查后處死小鼠，取血及心臟標(biāo)本，保存待檢。
　　3.心臟超聲、血脂和心臟質(zhì)量檢測(cè)
　　小鼠麻醉后，超聲檢測(cè)左室內(nèi)徑及后壁厚度，計(jì)算左室射血分

7、數(shù)和縮短分?jǐn)?shù)。禁食不禁飲12小時(shí)，稱重后取血處死，分離血漿以測(cè)血脂四項(xiàng);取心臟標(biāo)本，測(cè)量心臟質(zhì)量和左心室質(zhì)量，隨后垂直于心臟縱軸將左心室分為兩部分，一部分用置于包埋劑用作冰凍切片，另一分部保存于超低溫冰箱后期備用。
　　4.心肌纖維化，免疫熒光染色法，心肌細(xì)胞尺寸和數(shù)量的檢測(cè)
　　馬松染色檢測(cè)心肌纖維化。免疫熒光染色檢測(cè)各目標(biāo)蛋白在心臟組織中的表達(dá)。使用心肌肌鈣蛋白Ⅰ單抗標(biāo)記心肌細(xì)胞;檢測(cè)目標(biāo)蛋白如與心臟的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白尼

8、克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)，抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白超氧化物歧化酶1、2(SOD1、2)，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67，細(xì)胞老化相關(guān)蛋白P16INK4a。參考文獻(xiàn)方法測(cè)量心肌細(xì)胞尺寸和數(shù)量。
　　5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　細(xì)胞死亡原位檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法）用于檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)檢測(cè)心臟基因轉(zhuǎn)錄

9、表達(dá)情況
　　從心臟組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，QRT-PCR法檢測(cè)與細(xì)胞生長(zhǎng)周期、增殖、老化、P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、氧化應(yīng)激等相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.血脂四項(xiàng):ApoE-/-小鼠在8周齡時(shí)已進(jìn)展為高膽固醇血癥(TC和LDL-C較WT組分別上升3.7倍和8.7倍，甘油三酯(TG)不增高，HDL-C濃度較WT組下降23％）。16周齡時(shí)，ApoE-/-小鼠血脂變化趨勢(shì)類似。ASTⅣ治療ApoE-

10、/-小鼠8周后，血漿TC和LDL-C濃度較KO組上升，提示本實(shí)驗(yàn)中未觀察到ASTⅣ有降血漿膽固醇作用。
　　2.心臟質(zhì)量和尺寸:ApoE-/-小鼠8周齡時(shí)心臟較WT組已表現(xiàn)為心肌肥厚，其心臟質(zhì)量(HW，1.1倍)、左心室質(zhì)量（LVW，1.3倍）、心臟質(zhì)量體重比(HW/BW，1.1倍)、左心室質(zhì)量體重比（LVW/BW，1.3倍）以及左心室質(zhì)量心臟質(zhì)量比（LVW/HW，1.2倍）均顯著增加，左心室長(zhǎng)軸(LAX)也增加1.1倍。16周時(shí)

11、這些參數(shù)的差異仍然維持，ASTⅣ治療8周后，這些參數(shù)在AST-HD組較KO組分別下降了HW24％、LVW28％、HW/BW8％、LVW/BW10％、LVW/HW5％、LAX10％; AST-LD組沒(méi)有顯著改變。
　　3.心臟超聲檢測(cè)結(jié)果:與上述心臟質(zhì)量和尺寸的變化趨勢(shì)一致。8周齡時(shí)ApoE-/-小鼠較WT組左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)增加14％，左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)增加11％，左室舒張末期容積(LVEDV)和左室收縮末期容

12、積(LVESV)分別增加39％和30％。16周時(shí)，除LVDs外，ApoE-/-小鼠LVESV較WT組增加至35％，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、舒張期末左室后壁厚度(LVPWd)、收縮期末左室后壁厚度(LVPWs)分別下降11％、13％、13％、6％。提示高膽固醇血癥小鼠心臟室壁厚度變薄和收縮功能受損變化。經(jīng)AST V治療后，AST-HD組小鼠LAX減小，LVESV恢復(fù)，EF由54％上升至60％，F(xiàn)S由28％上升至31％。

13、AST-LD組較KO組在心臟超聲方面并沒(méi)有顯著差異。
　　4.心臟纖維化:8周齡ApoE-/-小鼠較WT組左心室膠原蛋白含量沒(méi)有差異，但16周時(shí)膠原蛋白分?jǐn)?shù)是WT組2倍，高劑量ASTⅣ治療后，膠原蛋白分?jǐn)?shù)減低至KO組一半。提示高膽固醇血癥易致心臟纖維化，ASTⅣ具有明顯抑制心臟纖維化作用。
　　5.心肌細(xì)胞體積和數(shù)量:8周齡ApoE-/-小鼠較WT組心肌細(xì)胞體積增加19％，心肌細(xì)胞數(shù)量無(wú)改變;16周，心肌細(xì)胞體積增加了38％

14、，心肌細(xì)胞數(shù)量減少了14％。而AST-LD和AST-HD組小鼠的心肌細(xì)胞體積較KO組的分別減低了19％和27％，AST-HD組小鼠的心肌細(xì)胞數(shù)量較KO組相比增加了10％。
　　6.增殖、老化蛋白的表達(dá):8周齡ApoE-/-小鼠較WT組ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)比例基本相等，16周時(shí)該比例減至WT組的80％，而高劑量ASTⅣ治療后該比例較KO組增加3倍，ki67陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)心臟細(xì)胞總數(shù)比例增加2倍。其次，8周齡ApoE-

15、/-小鼠較WT組在P16INK4a陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)比例無(wú)差異，16周時(shí)，該比例增為WT組的2.9倍，而低劑量和高劑量ASTⅣ治療后該比例較KO組分別減低了39％和60％。ki67陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)心臟細(xì)胞總數(shù)比例顯著減低55％。
　　7.心臟細(xì)胞凋亡:8周齡ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞凋亡(＜2％)與WT組無(wú)差異。16周齡ApoE-/-小鼠凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)比例超過(guò)WT組的23倍。AST-LD和AST-HD組的心肌

16、細(xì)胞凋亡較KO組分別減少了87％和90％。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)比例呈類似變化規(guī)律。
　　8.氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激:8周時(shí)ApoE-/-小鼠較WT組心臟NOX4陽(yáng)性細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)比例、SOD1和SOD2的陽(yáng)性表達(dá)面積均無(wú)顯著改變;16周時(shí)，ApoE-/-小鼠NOX4陽(yáng)性細(xì)胞占心臟總細(xì)胞比例是WT組的1.3倍，同時(shí)SOD2的陽(yáng)性表達(dá)面積顯著減小，SOD1相對(duì)表達(dá)面積沒(méi)有顯著差異。AST-LD和AST-HD組的NOX4陽(yáng)性細(xì)胞

17、占心臟總細(xì)胞比例較KO組分別降低16％和17％，SOD1和SOD2的表達(dá)則均無(wú)顯著改變。
　　9.目的基因轉(zhuǎn)錄:本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞周期、增殖、老化和P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的情況。
　　1)8周時(shí)，ApoE-/-小鼠較WT組Cyclin D1（2.2倍）和MCM5(2.7倍)上調(diào)，CDKN1A(70％)和CDKN1B(28％)下調(diào)，其余細(xì)胞周期相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著改變。16周時(shí)，ApoE-/-小鼠較WT組

18、反映細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的基因CDKN1A（7倍）、CDKN1B（2.7倍）、CDKN2A（9.6倍）明顯上調(diào)，其中CDKN2A上調(diào)與前述翻譯產(chǎn)物P16INK4a蛋白質(zhì)表達(dá)變化一致，而CDK4（2.2倍），Cyclin B1（11.3倍），Ki67(4.7倍)和MCM5(3.6倍)顯著上調(diào)，其中Ki67mRNA表達(dá)與前述蛋白表達(dá)不完全一致。ASTⅣ治療后CDKN1A，CDKN1B，CDKN2A，MCM5，Cyclin B1、D1、E1、A2和C

19、DK4在AST-LD和AST-HD兩組均顯著下調(diào)。
　　2)8周時(shí)，ApoE-/-小鼠心臟除P53上調(diào)（1.6倍）和Mcl1下調(diào)(27％)之外，其余檢測(cè)的P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因(TP53、Bax、Bcl2、caspase-3、Mdm2、ATM、GADD45A)較WT組沒(méi)有顯著差異;16周時(shí)除Bax和GADD45A外，其余檢測(cè)基因表達(dá)上調(diào)了2.5倍以上。ASTⅣ治療后上述基因表達(dá)顯著下調(diào)。
　　3)8周時(shí)，ApoE-/-小

20、鼠心臟與氧化應(yīng)激相關(guān)基因(Duox1、Srxn1、NOX1、NOX4、GPX2、SOD1)表達(dá)較WT組無(wú)顯著改變;16周時(shí)，除Duox1和SOD1外，余檢測(cè)基因均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，ASTⅣ治療后較KO組顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　本研究中觀察到ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞增殖能力減低，細(xì)胞老化、凋亡加重，心肌纖維化和心臟中P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)增高，這些與高膽固醇血癥小鼠發(fā)生心肌肥厚、心臟收縮功能下降等病理性心臟重