結(jié)腸癌相關(guān)生物標記物的驗證及功能研究.pdf

1、目的：課題組前期工作建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選腫瘤相關(guān)基因。SCRN1和BRG1為數(shù)據(jù)庫篩選出的結(jié)腸癌相關(guān)基因。本研究探索SCRN1和BRG1在結(jié)腸癌進展中的作用及其機制。
　　方法：
　　1．應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)腸癌細胞株RKO和HCT116中SCRN1表達。在干擾前后的細胞株中，MTT細胞增殖實驗和平板克隆形成實驗檢測腫瘤細胞增殖能力；Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力；ELISA實驗檢測細胞培養(yǎng)液中MMP

2、-2和MMP-9含量。
　　2．Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中BRG1 mRNA和蛋白表達差異（n=40）；結(jié)腸癌組織芯片（n=191）結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測結(jié)腸癌樣本中 BRG1蛋白表達情況，并分析其與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。構(gòu)建BRG1表達穩(wěn)定下調(diào)的結(jié)腸癌細胞株，體內(nèi)體外實驗研究 BRG1表達下調(diào)對結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲的影響。
　　結(jié)果：
　　1．結(jié)腸癌細胞中 S

3、CNR1表達下調(diào)后，細胞增殖能力顯著降低（RKO，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成顯著減少（RKO，P<0.01;HCT116，P<0.01）；Transwell實驗中穿膜細胞數(shù)目顯著減少（RKO，P<0.01; HCT116，P<0.01）；細胞培養(yǎng)液中MMP-2含量（RKO，P<0.001;HCT116，P=0.005）和 MMP-9含量（RKO，P=0.001;HCT116，P=0.037）顯著降低。

4、>　　2．40例配對的結(jié)腸癌和正常癌旁組織中，36例結(jié)腸癌組織中的BRG1 mRNA表達水平較其配對的正常粘膜組織增高，占總數(shù)的90%。免疫組織化學染色顯示BRG1主要在腫瘤細胞核內(nèi)表達，陽性表達的細胞呈棕黃色。BRG1表達增高與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無顯著關(guān)聯(lián)（P>0.05）；而與結(jié)腸癌患者的腫瘤浸潤深度（P<0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、遠處轉(zhuǎn)移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P

5、=0.017）、脈管侵犯（P=0.042）顯著相關(guān)。BRG1表達呈中等強度陽性及強陽性的患者術(shù)后總生存期較短（P<0.001），且更易復(fù)發(fā)（P=0.001）。BRG1表達下調(diào)后，結(jié)腸癌細胞增殖活性顯著減弱（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成顯著減少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）;Transwell實驗中穿膜細胞數(shù)目顯著減少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）。BR

6、G1表達下調(diào)后，DLD1細胞株在裸鼠皮下形成的腫瘤重量較陰性對照組顯著減?。≒<0.01）。結(jié)論：SCRN1和BRG1參與結(jié)腸癌進展，為潛在的腫瘤標志物和治療靶點。
　　第二部分 BRG1在結(jié)腸癌中的表達及其生物學功能研究
　　目的：課題組前期工作建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)BRG1為結(jié)腸癌相關(guān)基因，本研究探究BRG1在結(jié)腸癌患者中的臨床意義，及其在結(jié)腸癌細胞中的生物學功能。
　　方法：Real-time PCR檢測4

7、0對結(jié)腸癌組織和配對的正常結(jié)腸粘膜中BRG1 mRNA表達水平，并通過Western blot驗證BRG1的蛋白表達水平，通過免疫組化技術(shù)檢測組織芯片中191例結(jié)腸癌樣本BRG1表達的情況。統(tǒng)計學分析BRG1表達同患者臨床病理信息的相關(guān)性，利用Kaplan-Meier和Cox比例風險模型分析結(jié)腸癌中BRG1表達差異同患者術(shù)后生存情況的關(guān)聯(lián)。通過慢病毒干擾，構(gòu)建BRG1表達穩(wěn)定下調(diào)的結(jié)腸癌細胞株，體內(nèi)體外實驗探究 BRG1表達對結(jié)腸癌細胞

8、增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．Real-time PCR結(jié)果顯示：36對樣本出現(xiàn)BRG1表達增高，占90%（36/40），其中有26例增高達2倍以上，占65%（26/40）；Western blot結(jié)果顯示，在大部分結(jié)腸癌組織中BRG1蛋白水平高于對應(yīng)的正常結(jié)腸粘膜組織。
　　2．免疫組化結(jié)果顯示：BRG1主要在腫瘤細胞核內(nèi)表達，陽性表達細胞呈棕黃色。191例結(jié)腸癌組織中，多數(shù)BRG1表達

9、高于其對應(yīng)的正常粘膜組織；且差異具有統(tǒng)計學意義。BRG1表達增高同結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05），但與腫瘤浸潤程度（P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、遠處轉(zhuǎn)移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P=0.017）及脈管侵犯（P=0.042）顯著相關(guān)。
　　3．Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示BRG1高表達的患者術(shù)后總生存期及無瘤生存期較BRG1低表達的患者顯

10、著縮短（P<0.001，P=0.001）；Cox比例風險模型提示BRG1表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后有關(guān)，但不是獨立影響因素。
　　4．構(gòu)建針對 BRG1的慢病毒干擾載體，下調(diào)結(jié)腸癌細胞中 BRG1的表達，Real-time PCR及Western blot驗證BRG1基因的敲減效率達70%以上。
　　5．在 BRG1表達下調(diào)后，CCK-8增殖實驗提示結(jié)腸癌細胞的增殖能力受到抑制（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.00