液相質(zhì)譜新技術和新方法在糖胺聚糖分析中的應用研究.pdf

1、糖胺聚糖(GAGs)是一類由重復二糖結(jié)構(gòu)單元組成的長鏈大分子，在一系列生理過程如抗凝血、生長發(fā)育、血管生成、癌癥演變等中起著重要的作用。研究在生理病理變化過程中，細胞、組織和體液等生物樣本中GAGs組成和結(jié)構(gòu)的變化，有利于探明其發(fā)生發(fā)展或病變的機制。而天然的多糖是重要的生物活性物質(zhì)和藥物的來源，幾種GAGs衍生物藥物已經(jīng)臨床應用。近年來，海洋生物中GAGs類的硫酸多糖由于其特殊的生理功能和潛在的藥用價值越來越被研究者所關注。但是這些天然

2、多糖的分子量大且聚合度分散，完整的GAGs分子很難進行直接分析，需要特定的化學降解或酶解過程。因此，目前微量生物樣品中GAGs的高通量痕量分析、開發(fā)和建立新的寡糖制備方法以及解碼其復雜結(jié)構(gòu)序列的新方法均是目前亟待解決的科學問題。
　　本文依據(jù)先進的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，建立適用于GAGs研究的方法和策略，主要包括親水作用色譜(HILIC)與高分辨傅里葉變換質(zhì)譜(FT-MS)聯(lián)用，應用于GAGs的定性或定量分析;并建立基于質(zhì)譜多反應

3、監(jiān)測技術(MRM)的LC-MSMS高通量痕量分析微量生物樣本中GAGs方法，進而拓展這些方法在生物樣品中的應用。
　　首先，基于在線HILIC-FTMS分析結(jié)合糖生物信息化處理數(shù)據(jù)建立了快速、準確、全面鑒別抗凝血藥物低分子量肝素(LMWHs)的Bottom-up方法。該方法度靈敏高，可檢測低至0.01％的寡糖組分。色譜分析可在7 min內(nèi)完成，而糖生物信息化數(shù)據(jù)處理簡化了處理過程，極大的縮短了分析時間?；诒痉椒?，對三種來自不同生

4、產(chǎn)商的LMWHs中主要的不飽和寡糖、含有3-O-硫酸基的四糖、1，6-酐衍生物、非還原端的寡糖以及連接域寡糖等40多個組分的定量分析。該方法可以作為LMWHs的高通量分析方法，用于LMWHs生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
　　基于上述分析方法及建立的自由基降解GAGs的微反應體系，對肝素、硫酸軟骨素A、N-硫酸化-heparosan、過硫酸化硫酸軟骨素(OSCS)等四種不同類型的GAGs進行了輪廓分析，并研究了不同GAGs寡糖在HILIC

5、色譜柱上的保留特性。將以上策略應用于研究不能被特異性酶解、結(jié)構(gòu)特殊的GAGs海參巖藻糖基化的硫酸軟骨素(SC-FCS)的輪廓分析。此外，還針對肝素中三種可能存在過硫酸化的GAGs污染物(OSCS、過硫酸化硫酸乙酰肝素(OSHS)和N-硫酸化OSCS(NSOSCS))因結(jié)構(gòu)相似而難以鑒別的問題，通過自由基降解體系，以降解后產(chǎn)生的特異性二糖或三糖組分作為診斷離子，建立了HILIC-FTMS鑒別和定量分析肝素中復雜污染物的方法。通過本方法明確

6、了2008年肝素污染事件中主要的污染物為OSCS，同時能夠檢測一種新型潛在的肝素污染物NSOSCS。
　　內(nèi)源性的糖胺聚糖與許多重大疾病的發(fā)病機制相關。本文采用LC-MS分析方法研究了不同致病機制的呼吸衰竭病人血漿中GAGs的變化。在意識不清、間接性肺損傷和直接性肺損傷病人的血漿中CS的濃度未表現(xiàn)出明顯性變化，但是組成上，相對于健康對照組，CS-4S含量顯著降低，而CS-OS含量顯著增加。敗血癥、胰腺炎等間接性肺損傷病人血漿中HS

7、-GAGs的濃度和硫酸化程度均顯著性升高;并在敗血癥患者血漿中發(fā)現(xiàn)一個平均分子量為1.25KDa的特征性HS-GAGs寡糖組分;而胰腺炎病人病情變化過程中血漿HS-GAGs的濃度和硫酸化程度會隨著病情的好轉(zhuǎn)而降低，所以HS-GAGs可以作為敗血癥、胰腺炎等間接性肺損傷疾病的血液學標志物。直接性肺損傷的肺炎病人血漿中HA的濃度比健康對照組增加了31.53倍(p＜0.05)，其可以作為肺炎診斷的標志物。呼吸衰竭病人的致病機制不同，血漿中GA

8、Gs變化也存在特異性，說明在發(fā)病過程中GAGs的作用有差異，為疾病的治療提供指導和方向。
　　在上述研究基礎上，針對微量生物樣本中GAGs分析繁瑣、難以檢測的問題，建立了一種快速靈敏的微量生物樣品中GAGs的痕量分析方法。首先，提出了一種新的細胞中GAGs二糖富集的方法，與傳統(tǒng)方法相比，其樣品處理時間由原來的1～2周縮短為1～2天;其次，建立了以LC-MSMS-MRM技術同時分析17種GAGs二糖的方法，分析的LOD為0.16～1

9、.3pg，較現(xiàn)有的分析方法靈敏度提高了500多倍。在此基礎上，應用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞作為模型用于上述分析體系評價，結(jié)果顯示只需5000～10000個細胞便可定量分析其中所有的二糖組分，而在500個細胞時便可檢測到主要的二糖。并進一步利用該體系高通量測定了20株不同的人源細胞株中GAGs組學，豐富了這些細胞株的糖組學信息，并探討了它們的生物學特性和GAGs組學間的關系。該方法為數(shù)目較少或者難以富集的生物樣品中GAGs組學研究提供了