液相質(zhì)譜新技術(shù)和新方法在糖胺聚糖分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、糖胺聚糖(GAGs)是一類由重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)單元組成的長鏈大分子，在一系列生理過程如抗凝血、生長發(fā)育、血管生成、癌癥演變等中起著重要的作用。研究在生理病理變化過程中，細(xì)胞、組織和體液等生物樣本中GAGs組成和結(jié)構(gòu)的變化，有利于探明其發(fā)生發(fā)展或病變的機(jī)制。而天然的多糖是重要的生物活性物質(zhì)和藥物的來源，幾種GAGs衍生物藥物已經(jīng)臨床應(yīng)用。近年來，海洋生物中GAGs類的硫酸多糖由于其特殊的生理功能和潛在的藥用價(jià)值越來越被研究者所關(guān)注。但是這些天然

2、多糖的分子量大且聚合度分散，完整的GAGs分子很難進(jìn)行直接分析，需要特定的化學(xué)降解或酶解過程。因此，目前微量生物樣品中GAGs的高通量痕量分析、開發(fā)和建立新的寡糖制備方法以及解碼其復(fù)雜結(jié)構(gòu)序列的新方法均是目前亟待解決的科學(xué)問題。
　　本文依據(jù)先進(jìn)的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立適用于GAGs研究的方法和策略，主要包括親水作用色譜(HILIC)與高分辨傅里葉變換質(zhì)譜(FT-MS)聯(lián)用，應(yīng)用于GAGs的定性或定量分析;并建立基于質(zhì)譜多反應(yīng)

3、監(jiān)測技術(shù)(MRM)的LC-MSMS高通量痕量分析微量生物樣本中GAGs方法，進(jìn)而拓展這些方法在生物樣品中的應(yīng)用。
　　首先，基于在線HILIC-FTMS分析結(jié)合糖生物信息化處理數(shù)據(jù)建立了快速、準(zhǔn)確、全面鑒別抗凝血藥物低分子量肝素(LMWHs)的Bottom-up方法。該方法度靈敏高，可檢測低至0.01％的寡糖組分。色譜分析可在7 min內(nèi)完成，而糖生物信息化數(shù)據(jù)處理簡化了處理過程，極大的縮短了分析時(shí)間。基于本方法，對(duì)三種來自不同生

4、產(chǎn)商的LMWHs中主要的不飽和寡糖、含有3-O-硫酸基的四糖、1，6-酐衍生物、非還原端的寡糖以及連接域寡糖等40多個(gè)組分的定量分析。該方法可以作為LMWHs的高通量分析方法，用于LMWHs生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
　　基于上述分析方法及建立的自由基降解GAGs的微反應(yīng)體系，對(duì)肝素、硫酸軟骨素A、N-硫酸化-heparosan、過硫酸化硫酸軟骨素(OSCS)等四種不同類型的GAGs進(jìn)行了輪廓分析，并研究了不同GAGs寡糖在HILIC

5、色譜柱上的保留特性。將以上策略應(yīng)用于研究不能被特異性酶解、結(jié)構(gòu)特殊的GAGs海參巖藻糖基化的硫酸軟骨素(SC-FCS)的輪廓分析。此外，還針對(duì)肝素中三種可能存在過硫酸化的GAGs污染物(OSCS、過硫酸化硫酸乙酰肝素(OSHS)和N-硫酸化OSCS(NSOSCS))因結(jié)構(gòu)相似而難以鑒別的問題，通過自由基降解體系，以降解后產(chǎn)生的特異性二糖或三糖組分作為診斷離子，建立了HILIC-FTMS鑒別和定量分析肝素中復(fù)雜污染物的方法。通過本方法明確

6、了2008年肝素污染事件中主要的污染物為OSCS，同時(shí)能夠檢測一種新型潛在的肝素污染物NSOSCS。
　　內(nèi)源性的糖胺聚糖與許多重大疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本文采用LC-MS分析方法研究了不同致病機(jī)制的呼吸衰竭病人血漿中GAGs的變化。在意識(shí)不清、間接性肺損傷和直接性肺損傷病人的血漿中CS的濃度未表現(xiàn)出明顯性變化，但是組成上，相對(duì)于健康對(duì)照組，CS-4S含量顯著降低，而CS-OS含量顯著增加。敗血癥、胰腺炎等間接性肺損傷病人血漿中HS

7、-GAGs的濃度和硫酸化程度均顯著性升高;并在敗血癥患者血漿中發(fā)現(xiàn)一個(gè)平均分子量為1.25KDa的特征性HS-GAGs寡糖組分;而胰腺炎病人病情變化過程中血漿HS-GAGs的濃度和硫酸化程度會(huì)隨著病情的好轉(zhuǎn)而降低，所以HS-GAGs可以作為敗血癥、胰腺炎等間接性肺損傷疾病的血液學(xué)標(biāo)志物。直接性肺損傷的肺炎病人血漿中HA的濃度比健康對(duì)照組增加了31.53倍(p＜0.05)，其可以作為肺炎診斷的標(biāo)志物。呼吸衰竭病人的致病機(jī)制不同，血漿中GA

8、Gs變化也存在特異性，說明在發(fā)病過程中GAGs的作用有差異，為疾病的治療提供指導(dǎo)和方向。
　　在上述研究基礎(chǔ)上，針對(duì)微量生物樣本中GAGs分析繁瑣、難以檢測的問題，建立了一種快速靈敏的微量生物樣品中GAGs的痕量分析方法。首先，提出了一種新的細(xì)胞中GAGs二糖富集的方法，與傳統(tǒng)方法相比，其樣品處理時(shí)間由原來的1～2周縮短為1～2天;其次，建立了以LC-MSMS-MRM技術(shù)同時(shí)分析17種GAGs二糖的方法，分析的LOD為0.16～1

9、.3pg，較現(xiàn)有的分析方法靈敏度提高了500多倍。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞作為模型用于上述分析體系評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示只需5000～10000個(gè)細(xì)胞便可定量分析其中所有的二糖組分，而在500個(gè)細(xì)胞時(shí)便可檢測到主要的二糖。并進(jìn)一步利用該體系高通量測定了20株不同的人源細(xì)胞株中GAGs組學(xué)，豐富了這些細(xì)胞株的糖組學(xué)信息，并探討了它們的生物學(xué)特性和GAGs組學(xué)間的關(guān)系。該方法為數(shù)目較少或者難以富集的生物樣品中GAGs組學(xué)研究提供了