影響碳納米管免疫安全性因素的研究.pdf

1、由于獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的電熱理化性能，碳納米管(carbon nanotube，CNTs)在電子器件、復(fù)合材料及生物醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。目前有關(guān)碳納米管的研究主要著重于它的應(yīng)用方面，其安全性研究尚處于初級(jí)階段，大多數(shù)研究主要局限于肺和巨噬細(xì)胞對(duì)碳納米管的反應(yīng)。由于碳納米管種類繁多，彼此之間存在很大的差異，而且評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也不統(tǒng)一，導(dǎo)致得出的研究結(jié)果不盡相同，甚至有些結(jié)果完全相反，因此關(guān)于碳納米管的安全性問題有待進(jìn)一步系統(tǒng)深入

2、地研究。
　　本文主要研究21種不同類別、直徑、長(zhǎng)度和官能團(tuán)修飾的CNTs在相同研究條件下對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。體外實(shí)驗(yàn)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)與終濃度分別為25、50、100或200μg/mL的21種CNTs共培養(yǎng)，分別在12h、24h、48h和72h時(shí)間點(diǎn)，通過檢測(cè)LDH的漏出率觀察細(xì)胞膜的破壞程度、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量觀察孵育后的細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力，

3、并通過檢測(cè)孵育24h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的濃度觀察免疫炎癥情況。體外補(bǔ)體消耗實(shí)驗(yàn)將正常人新鮮血清與終濃度分別為25、50、100或200μg/mL的21種CNTs共孵育1h后，通過檢測(cè)血清中補(bǔ)體因子的含量觀察補(bǔ)體激活情況及急性炎癥反應(yīng)。
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用非暴露式氣管滴注法向每只小鼠體內(nèi)注入40μL(0.5或5mg/mL)的碳納米管溶液，分別于第1、3和7天從球后靜脈叢取血，于滴注7天后，將小鼠安樂死并分別稱取小鼠體重

4、及其肺臟和脾臟的重量，計(jì)算肺和脾的臟器系數(shù);對(duì)左側(cè)肺進(jìn)行肺泡灌洗，并將右側(cè)部分肺進(jìn)行組織勻漿，離心取上清，通過ELISA方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的非特異性免疫細(xì)胞因子、肺泡灌洗液和肺組織勻漿上清液中的氧化及纖維化因子SOD、MDA、TGF-β、PDGF、IL-1β、TNF-α、IL-6和HYP，以觀察各碳納米管引起的炎癥反應(yīng)的變化及規(guī)律。分別于氣管滴注后第1、7和28天從球后靜脈叢取血，檢測(cè)血清中補(bǔ)體分子（C1q、 MASP和C3）的含量

5、從而反映小鼠補(bǔ)體的激活情況及激活方式。
　　體外細(xì)胞毒性研究結(jié)果顯示，不論大小、長(zhǎng)度、表面修飾和類型，所有的碳納米管在一定劑量下都對(duì)PBMCs表現(xiàn)出了明確的細(xì)胞毒性，而小直徑的單壁碳納米管誘導(dǎo)的氧化毒性最高，盡管對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷強(qiáng)度一般。值得注意的是，薄壁碳納米管較厚壁的細(xì)胞毒性更顯著，而長(zhǎng)度較短的碳納米管相比更長(zhǎng)的CNTs的細(xì)胞毒性更顯著。碳納米管的細(xì)胞毒性很可能是碳納米管的細(xì)胞內(nèi)化引起的ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致的。體外免疫毒

6、性結(jié)果顯示，碳納米管可以引起急性炎癥反應(yīng)、激活補(bǔ)體系統(tǒng)，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。在相似的長(zhǎng)度下，直徑越小，越容易引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，直徑較大的多壁碳納米管可以通過結(jié)合MASP顯著激活凝集素途徑。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們觀察到所有組CNTs作用的小鼠的臟器系數(shù)都較對(duì)照組有所增加，確認(rèn)了碳納米管在體內(nèi)的免疫原性特性。相同類型、直徑和長(zhǎng)度下，三種不同修飾的CNTs相比，P-CNTs能引起更嚴(yán)重的肺部炎癥，而10mg/kg劑量下CNTs-COOH

7、則能誘發(fā)更嚴(yán)重的脾臟炎癥，因此，P-CNTs可能導(dǎo)致直接毒性而CNTs-COOH則易于誘導(dǎo)間接免疫毒性。1mg/kg劑量下F-CNTs較P-CNTs表現(xiàn)出引起較低的炎性刺激，表明碳納米管的功能化能顯著降低其肺部炎癥;當(dāng)以10mg/kg劑量給藥，F(xiàn)-CNTs包括CNTs-COOH和CNTs-OH誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，證實(shí)碳納米管和肺部炎癥之間呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。碳納米管可降低肺SOD活性，同時(shí)增加MDA的量。應(yīng)用1mg/kg劑量時(shí)，P-

8、CNTs顯示出更顯著效果的氧化應(yīng)激，而CNTs-OH和CNTs-COOH則在使用10mg/kg劑量時(shí)表現(xiàn)出更顯著的效果。幾乎所有的碳納米管引起顯著的體內(nèi)炎癥反應(yīng)，顯示為IL-1β、IL-6和TNF-α的水平增加，相比CNTs-COOH和CNTs-OH，幾乎所有類型的P-CNTs，包括P-SWNTs和P-MWCNTs，氣管滴注后會(huì)誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。P-CNTs和CNTs-COOH顯著促進(jìn)IL-2的分泌。Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-

9、4、IL-5和IL-10）和Th17型細(xì)胞因子（IL-17A和IL-22）在體內(nèi)的產(chǎn)生也可由P-CNTs和CNTs-COOH刺激，此外，CNTs-OH相比P-CNTs引起較弱的細(xì)胞因子分泌。補(bǔ)體結(jié)果表明，碳納米管能在短時(shí)間內(nèi)引起補(bǔ)體的激活，且在28天后，補(bǔ)體因子濃度逐漸恢復(fù)至正常水平。最小的SWNTs組能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成補(bǔ)體蛋白，并且對(duì)三種單壁碳納米管誘導(dǎo)合成C3因子的時(shí)間的差異取決于他們進(jìn)入細(xì)胞的速率。
　　CNTs的類型、直徑