Ucf-101對(duì)匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　癲癇（epilepsy，EP）是神經(jīng)內(nèi)科最常見的慢性腦部疾病之一。癲癇發(fā)作嚴(yán)重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量，也給社會(huì)帶來(lái)了重大的負(fù)面影響。動(dòng)物模型和臨床研究已經(jīng)表明，長(zhǎng)時(shí)間的癲癇發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)可造成腦部多個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元凋亡，其中海馬神經(jīng)細(xì)胞受損最為明顯。
　　Omi/HtrA2（high-temperaturerequirementserineproteaseA2）是一種線粒體絲氨酸蛋白酶，屬于促凋亡因

2、子，可通過(guò)半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyaspartatespecificprotease，caspase）依賴途徑或者非caspase依賴途徑參與細(xì)胞凋亡。在正常的生理情況下，成熟的Omi/HtrA2主要儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)、外膜之間的膜間隙中。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，凋亡誘導(dǎo)因子作用于線粒體，使線粒體外膜通透性增加，Omi/HtrA2進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisp

3、rotein，IAPs），并使其裂解，從而解除IAPs對(duì)caspase-3、7、9的抑制，激活caspase級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)，各種凋亡刺激作用于細(xì)胞時(shí)，Omi/HtrA2通過(guò)其蛋白水解活性，可降解或清除線粒體抗凋亡蛋白（HIS-associatedproteinX-1，HAX-1），激活不依賴caspase的細(xì)胞凋亡途徑。
　　Omi/HtrA2絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑（undeterminedcertainfac

4、tor，Ucf-101）是Omi/HtrA2的特異性抑制劑，它通過(guò)抑制其活性，阻斷Omi/HtrA2的caspase和非caspase依賴凋亡途徑，從而發(fā)揮抑制凋亡的作用。已有研究表明，Ucf-101對(duì)心、肺、腎等器官的細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且可減少腦缺血-再灌注及神經(jīng)退行性病變所引起的神經(jīng)元凋亡，但其對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的作用目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立氯化鋰-匹魯卡品（Lithium-pilocarpine，PILO）誘導(dǎo)SD大

5、鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)模型，采用HE、Nissl、TUNEL及免疫組化染色法檢測(cè)海馬組織損傷及細(xì)胞凋亡情況，觀察Ucf-101對(duì)匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，并通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)元中Omi/HtrA2、caspase9及HAX-1表達(dá)水平的變化，來(lái)初步探討其中的可能機(jī)制。
　　材料與方法：
　　160只健康雄性SD大鼠，6-8周，體重200-250g，隨機(jī)分為CON組、PILO組、PIL

6、O+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和PILO+Ucf-101高劑量組，PILO組包括2h組、6h組、12h組、24h亞組，每組各20只。所有SD大鼠均行腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)預(yù)處理。20h后對(duì)PILO組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101組進(jìn)行腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)處理，為了拮抗匹魯卡品的外周膽堿能作用，在此之前的30min需要皮下注射氫溴酸東莨菪堿(1mg/kg)。并且在注射匹魯卡品前

7、10min，PILO+Ucf-101低劑量組和PILO+Ucf-101高劑量組需要分別腹腔注射Ucf-1010.7umol/kg和1.5umol/kg，PILO+DMSO組用等體積的DMSO代替Ucf-101。CON組腹腔注射等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。根據(jù)Racine癇性發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到Ⅳ或Ⅴ級(jí)為造模成功。SE持續(xù)60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止發(fā)作。記錄各組大鼠致癇成功率、存活率及發(fā)作潛伏期。取CON組、PILO

8、24h亞組、PILO+DMSO組及PILO+Ucf-101組造模成功且存活的大鼠總數(shù)的一半麻醉后灌注取腦，采用HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及免疫組化染色法檢測(cè)海馬神經(jīng)元損傷及凋亡情況；剩余大鼠麻醉后取出雙側(cè)海馬，采用Westernblot法檢測(cè)Omi/HtrA2、caspase9及HAX-1表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、行為學(xué)觀察：CON組SD大鼠無(wú)癲癇發(fā)作，PILO組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-

9、101組大鼠出現(xiàn)不同形式的癲癇發(fā)作。各組大鼠癲癇成功率及發(fā)作潛伏期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　2、HE染色結(jié)果：與CON組相比較，PILO24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PILO+DMSO組較PILO24h亞組神經(jīng)元數(shù)量減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。PILO+Ucf-101組海馬神經(jīng)元數(shù)目多于P

10、ILO24h亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目多于PILO+Ucf-101低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、Nissl染色結(jié)果：與CON組相比，PILO24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101低劑量組和Ucf-101高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05)。PILO+DMSO組較PILO24h亞組神經(jīng)元數(shù)量減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。

11、與PILO24h亞組相比較，PILO+Ucf-101組海馬神經(jīng)元數(shù)目均增多(P<0.05)。PILO+Ucf-101高劑量組較PILO+Ucf-101低劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05)。
　　4、TUNEL染色結(jié)果：PILO24h亞組、PILO+DMSO組和PILO+Ucf-101組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞多于CON組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；PILO+DMSO組較PILO24h亞組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>

12、0.05)。與PILO24h亞組相比，PILO+Ucf-101組海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；與PILO+Ucf-101低劑量組比較，PILO+Ucf-101高劑量組海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　5、免疫組化染色結(jié)果：與CON組相比，PILO24h亞組、PILO+DMSO組、PILO+Ucf-101組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)增高（P<0.05），

13、與PILO24h亞組相比，PILO+Ucf-101組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)減少（P<0.05），且PILO+Ucf-101低劑量組少于PILO+Ucf-101高劑量組（P<0.05）。與CON組相比，PILO24h亞組、PILO+DMSO組HAX-1表達(dá)減少（P<0.05），與PILO24h亞組相比，PILO+Ucf-101組HAX-1表達(dá)增多（P<0.05），且PILO+Ucf-101高劑量組較PILO+Ucf-10

14、1低劑量組表達(dá)增高（P<0.05）。PILO+DMSO組較PILO24h亞組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)升高（P>0.05)，HAX-1表達(dá)降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　6、Westernblot結(jié)果：與CON組相比，PILO組Omi/HtrA2、caspase92h開始升高(p<0.05)，24h達(dá)高峰(P<0.05)；HAX-12h開始升高(P<0.05)，6小時(shí)達(dá)峰(P<0.05)，然后下降，1

15、2h、24h均低于CON組(P<0.05)。與PILO24h亞組比較，PILO+Ucf-101組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)降低（P<0.05），HAX-1升高（P<0.05）；與PILO+Ucf-101低劑量組比較，PILO+Ucf-101高劑量組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)降低（P<0.05），HAX-1升高（P<0.05）。PILO+DMSO組較PILO24h亞組Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)升高

16、（P>0.05)，HAX-1表達(dá)降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、癲癇發(fā)作后24h內(nèi)Omi/HtrA2、caspase9表達(dá)持續(xù)增高，HAX-1表達(dá)早期增高，6h后降低，證實(shí)癲癇發(fā)作可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　2、Ucf-101可減少致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，對(duì)癲癇后腦損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制Omi/HtrA2和caspase9表達(dá)，增加HAX-1表達(dá)相關(guān)。
　　3、Ucf-101的神