氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬線粒體損傷及抗氧化防御與修復(fù)系統(tǒng)的研究.pdf

1、癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病,給社會(huì)、家庭及患者個(gè)人都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。我國(guó)目前約有900萬(wàn)癲癇患者,其中有25-40％為難治性癲癇。顳葉癲癇(temporallobe epilepsy,TLE)是最常見(jiàn)的難治性癲癇類型,其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚,藥物及手術(shù)治療常難以獲得明顯療效。氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠行為學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)和海馬神經(jīng)元損傷的病理學(xué)改變均與人類顳葉癲癇相似,因此該模型是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticu

2、s,SE)和TLE的常用模型之一。
　　 我們前期通過(guò)建立慢性癲癇模型發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作后氧化呼吸鏈功能受損與線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)編碼亞基mRNA及蛋白合成缺陷有關(guān)。有研究表明癲癇發(fā)作產(chǎn)生大量自由基堆積于線粒體,與核DNA(nuclear DNA,nDNA)相比,mtDNA更易受損,故推測(cè)癲癇發(fā)作后mtDNA可能存在嚴(yán)重的氧化損傷從而導(dǎo)致影響其編碼功能、影響線粒體呼吸鏈功能。癲癇發(fā)作能造成線

3、粒體呼吸鏈活性下降、超微結(jié)構(gòu)受損已被廣泛認(rèn)可,線粒體功能的異常是神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一,因此對(duì)線粒體損傷及代償機(jī)制的研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　 正常的生理代謝活動(dòng)下,線粒體可產(chǎn)生一定量的自由基,后者可損傷線粒體基因組,但機(jī)體存在健全的抗氧化機(jī)制,以維持遺傳信息的穩(wěn)定性。第一道防線為自由基清除系統(tǒng),如SOD、GSH等,負(fù)責(zé)盡可能地清除自由基；第二道防線為DNA修復(fù)系統(tǒng),負(fù)責(zé)修復(fù)各種因?yàn)閷?dǎo)致的基因組的損傷。癲癇發(fā)作后,這兩大代償

4、系統(tǒng)的反應(yīng)性可能決定神經(jīng)元及線粒體的損傷程度。
　　 為此,本課題建立氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠模型,探討癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷的病理學(xué)及分子生物學(xué)特征；檢測(cè)癲癇模型中海馬mtDNA的氧化損傷；檢測(cè)兩道抗氧化防線的反應(yīng)性,以此深入研究癲癇的發(fā)病機(jī)制。本研究分四個(gè)部分:
　　 第一部分氯化鋰-匹魯卡品大鼠急慢性癲癇模型的建立及腦電圖、海馬神經(jīng)元損傷的病理學(xué)觀察
　　 目的：
　　 建立氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)的

5、大鼠急、慢性癲癇模型,觀察大鼠的行為學(xué)、電生理學(xué)及海馬組織病理學(xué)改變。
　　 方法
　　 成年雄性Wistar大鼠腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE),觀察大鼠行為學(xué)變化。SE持續(xù)60 min后腹腔注射地西泮終止發(fā)作。于致癇后3h對(duì)大鼠進(jìn)行EEG描記；多聚甲醛灌注取腦,石蠟包埋切片,Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元的損傷:其后每天觀察記錄大鼠有無(wú)自發(fā)性癇性發(fā)作(sponta

6、neous recurrent seizures,SRS)。
　　 結(jié)果：
　　 1.根據(jù)Racine發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到Ⅳ-Ⅴ級(jí)發(fā)作的大鼠被認(rèn)為是誘發(fā)SE成功,表現(xiàn)為雙側(cè)前肢的陣攣、抽搐及全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作,雙側(cè)后肢強(qiáng)直伴身體直立、軀干背曲強(qiáng)直、跌倒。誘發(fā)SE的成功率為83.1％,潛伏期38.5±18.7min,72h內(nèi)死亡率為23.2％。平均靜止期為12.7±6.2天。有74％的大鼠觀察到每周1-3次Ⅰ級(jí)到Ⅴ級(jí)的不同

7、形式的自發(fā)性發(fā)作,表現(xiàn)基本同急性期,但持續(xù)時(shí)間較短暫,每次很少超過(guò)1min。
　　 2.癲癇發(fā)作后3 h(急性期)大鼠皮層和海馬區(qū)的EEG均可記錄到叢集性棘波放電。
　　 3.Nissl染色顯示癲癇大鼠海馬的CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元丟失,排列疏松,輪廓模糊,界限不清,可見(jiàn)部分神經(jīng)元胞體皺縮,核固縮,胞漿深染,胞漿內(nèi)尼氏小體減少。
　　 結(jié)論：
　　 根據(jù)氯化鋰-匹魯卡品腹腔注射后大鼠的行為學(xué)和EEG改變,說(shuō)

8、明氯化鋰-匹魯卡品可致大鼠急、慢性癲癇發(fā)作,氯化鋰-匹魯卡品致癇后可引起大鼠海馬神經(jīng)元損傷。
　　 第二部分氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)改變和線粒體基因組損傷的研究
　　 目的：
　　 觀察氯化鋰-匹魯卡品致癇后急、慢性癲癇大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)變化,研究線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷貝量的改變,檢測(cè)海馬mtDNA氧化堿基水平,進(jìn)一步探討癲癇致海馬線粒體損傷的分子生

9、物學(xué)機(jī)制。
　　 方法
　　 成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為急性對(duì)照組、急性癲癇組(SE后25h)、慢性對(duì)照組、慢性癲癇組(SE后60d)。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦,電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。分離海馬,提取基因組DNA。RQ-PCR法分別檢測(cè)三段不同區(qū)域mtDNA與nDNA的比例,從而反應(yīng)mtDNA拷貝水平；比較三段不同區(qū)域拷貝量以排除mtDNA大片段缺失對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后,以Fpg(formamidopyrim

10、idine DNA glycosylase)孵育切除氧化損傷堿基。由于氧化堿基切除后該處形成缺口,阻止PCR通過(guò)此處擴(kuò)增,RQ-PCR法檢測(cè)Fpg孵育后與孵育前mtDNA的比例,可以反映完好堿基的比例;比較三段不同區(qū)域完好堿基的百分比可排除可能的氧化損傷熱點(diǎn)對(duì)結(jié)果的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.急性期與慢性期癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的線粒體均呈現(xiàn)不同程度的損傷,表現(xiàn)為間隙腫脹,線粒體基質(zhì)消失,結(jié)構(gòu)破壞,重者線粒體明顯空泡化。

11、
　　 2.與急性對(duì)照組相比,急性癲癇組大鼠海馬mtDNA拷貝量無(wú)明顯變化(p>0.05),三段不同區(qū)域的mtDNA片段的拷貝量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 3.Fpg孵育后,急性癲癇組與急性對(duì)照組mtDNA拷貝量無(wú)明顯變化(p>0.05),孵育后三段不同區(qū)域的mtDNA片段拷貝量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 4.與慢性對(duì)照相比,慢性癲癇大鼠海馬mtDNA拷貝量明顯降低(p<0.05),三段不同區(qū)

12、域的mtDNA片段的拷貝量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 5.Fpg孵育后,癲癇組比對(duì)照組mtDNA拷貝量下降更為明顯(p<0.05),孵育后三段不同區(qū)域的mtDNA片段拷貝量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 氯化鋰-匹魯卡品所致的SE模型中,mtDNA拷貝量無(wú)明顯變化,未檢測(cè)出明顯增加的氧化位點(diǎn)。氯化鋰-匹魯卡品所致的慢性癲癇模型中,mtDNA拷貝量明顯下降,且線粒體基因組內(nèi)存在大量的氧

13、化堿基,目前尚未發(fā)現(xiàn)明顯的易損區(qū)域。本研究闡明了反復(fù)癇性發(fā)作可致海馬線粒體基因組損傷,氧化應(yīng)激可能是損傷的重要病理機(jī)制。
　　 第三部分氯化鋰-匹魯卡品致瘸大鼠海馬抗氧化防御體系反應(yīng)性的探討
　　 目的：
　　 檢測(cè)匹魯卡品致癇大鼠模型中海馬組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,評(píng)估自由基清除劑超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的水平及海馬氧化還原狀態(tài),從而進(jìn)一步探討線粒體氧化損傷的機(jī)制。
　

14、　 方法
　　 成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為急性對(duì)照組、SE后3h、SE后25h、慢性對(duì)照組、慢性癲癇組(SE后60d)。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別斷頭取腦,分離海馬,檢測(cè)丙二醛(malonaldehyde,MDA)、SOD、谷胱甘肽(glutathione,GSH)。
　　 結(jié)果：
　　 1.MDA在SE發(fā)作后3h、25h及60d均有顯著升高。
　　 2.GSH在SE發(fā)作后3h無(wú)明顯變化,25h及60d組明

15、顯下降。
　　 3.總SOD含量在SE發(fā)作后3h無(wú)明顯變化,在25h及60d組則呈明顯下降；SOD1在各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯差異；SOD2在SE發(fā)作后3h無(wú)明顯變化,在25h及60d組則呈明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 癲癇發(fā)作后,癲癇組存在脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；內(nèi)源性自由基清除劑在各實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這證實(shí)了癲癇發(fā)作后海馬氧化應(yīng)激水平的增高,以及自由基生成與清除的平衡被打破。此外,SOD1不變而SOD2下降提示癲癇發(fā)作

16、后線粒體可能是自由基攻擊的中心。
　　 第四部分氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬mtDNA修復(fù)機(jī)制的研究
　　 目的：
　　 評(píng)估匹魯卡品致癇后大鼠海馬中的線粒體堿基切除修復(fù)通路各個(gè)關(guān)鍵酶在基因和蛋白水平表達(dá)的改變,從而進(jìn)一步探討線粒體基因組損傷的機(jī)制。
　　 方法
　　 成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為急性對(duì)照組、SE后3h、9h、25h組、慢性對(duì)照組、慢性癲癇組。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別斷頭取腦,分離海馬

17、,RQ-PCR法檢測(cè)關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)；取新鮮海馬提取線粒體,Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.RQ-PCR顯示OGG1和polγ mRNA在癲癇發(fā)作后3h、9h和25h表達(dá)明顯降低；而各個(gè)時(shí)間點(diǎn)APE1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 2.Western blot示急性期線粒體內(nèi)OGG1和polγ的表達(dá)在3h、9h和25h表達(dá)明顯降低；線粒體內(nèi)APE1的表達(dá)在3h、9h降低,

18、25h恢復(fù)至正常水平；而急性期各組APE1在海馬組織水平的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。
　　 3.慢性癲癇組polγ mRNA表達(dá)較對(duì)照組增高APE1的mRNA未見(jiàn)明顯改變。
　　 4.慢性癲癇組線粒體內(nèi)polγ蛋白的表達(dá)較對(duì)照組增加,APE1的表達(dá)則明顯下降,但APE1在海馬組織水平的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.與polγ的改變相似,慢性癲癇組Tfam的mRNA和蛋白水平均顯著增高。
　　 結(jié)論：